1 Technieken uit de gentechnologie
1.1 DNA en RNA isolatie
mRNA met poly(A)-staart aan 3’ eind → isolatie via poly(T)-oligonucleotide mbv magnetische beads.
Rnase (exonuclease die RNA kapot maakt) vrij werken
Waterfase → RNA
Interfase → gedenatureerde EW + genomisch DNA
Organische fase → EW + lipiden
Neerslaan RNA als pellet door isopropanol preciptatie
RNA gelelektroforese:
1 en 2: intact RNA met 28S:18S rRNA (ribosomaal RNA) ratio van 2:1
3: gedegradeerd RNA met smeer onder 28S en 18S
4: RNA degradatie → verlies van 28s + opstapeling gedegradeerd
RNA onderaan gel
5: RNA met contaminatie van genomisch DNA
28S/18S= grote/kleine ribosomale subeenheid
DNA isoleren door denaturatie (mbv zouten) en extractie:
- Adsorptie van silicaatdeeltjes
- Filtratie over semi-permeabele membraan waaraan DNA blijft plakken dmv chaotrope stof
Detectie:
- UV-absorptie bij 260 nm (EW 280 nm)
- OD ratio 260nm/280nm → 1,8 – 2,0 → zuiver
1.2 DNA detectie
1.2.1 Elektroforese
1.2.1.1 Gel-elektroforese
Negatief geladen fosfaatgroepen → nucleïnezuren bij neutrale pH naar positieve pool
Agarose/ polyacrylamide matrices → hoe hoger C, hoe moeilijker NZ in agarosegel migreren
Kleurstoffen:
- Ethidiumbromide: carcinogeen → alternatief: SYBR Green
- SYBR Green/ SYBR Safe:
o Intercalerend (mogelijk mutageen)
o Cytotoxisch (penetreert cellen)
1.2.1.2 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE)
Scheiding van grote DNA fragmenten
Wisselend elektrisch veld
Kleine moleculen passen zich sneller aan dan grote → netto mobiliteit tussen beide verschilt
Langdurig proces (2 tot 7 dagen)
Elektrisch veld staat onder een hoek van 45°C op de
migratierichting. Veld wisselt telkens van richting.
Paarse pijl: migratierichting
AD Gentechnologie 1
,1.2.2 Hybridisatie
Detectie van DNA/RNA target met een probe (= kort stukje ssDNA, gemerkt, complementair aan
target)
Waar:
- In oplossing
- Op vaste darge
- FISH: Fluorescente In Situ Hybridisatie: op cellen of weefsels
Hybridisatie Complementaire DNA/RNA strengen vormen H-bruggen
Denatureren/ smelten Breken van H-bruggen die twee strengen bij elkaar houden
a. Vermeerdering DNA
b. Merken van probe-DNA met hapteen of fluorescent
molecule
c. Denaturatie probe door koken/ pH veranderen.
Doelsequentie gedenatureerd
d. Hybridisatie van probe op DNA.
Probe en doelsequentie met zichzelf renatureren
e. Wassen voor verwijderen niet-gebonden probe.
Merker detecteren:
- hapteen herkend door AL die merker draagt.
- fluorescente molecule meten met juiste golflengte.
1.2.2.1 DNA probes
Specifieke probes voor:
- MO
- Oncogenen (gen dat wij allemaal hebben, potentiaal gevaarlijk gen om cellen te groeien)
- Tumorsuppressor genen (P53)
- Gemuteerd humaan DNA/ uniek humaan DNA
Labelen met:
- Radionucleotiden (35S, 3H)
- Fluorochromen (Cy3)
- Hapteen (biotine)
- Immunogene groepen
- Enzymen (alkalische fosfatase, peroxidase)
1.2.2.1.1 Bereiding
1. Aanmaak grote hoeveelheden DNA of RNA
2. Labeling (tijdens of na synthese)
Met PCR: dsDNA bereiden → labeling door gemerkte dNTP’s
Probes te lang → via recombinant-DNA technieken
1.2.2.1.2 Labeling
3’ eind met TdT:
Toevoegen van gelabelde nucleotiden aan 3’-uiteinde
van ssDNA mbv TdT (= terminaal
deoxynucleotidyltransferase)
AD Gentechnologie 2
,5’-eind:
Fosfaat verwijderen met fosfatase (CIP)
Hydroxylgroep op plek van vroegere fosfaatgroep
Fosfatase remover reagens toevoegen (fenolextractie)
Centrifugeren
Fosfaatgroep terug toevoegen met kinase
Molecule is gelabeld
Nick-translatie:
Nicks/gaten gemaakt met DNase I (endonuclease)
Polymerase I maakt streng opnieuw aan vanaf 3’ OH met
gelabelde nucleotiden
Gap verplaatst door afbraak bestaande streng door 5’-3’
exonuclease activiteit van DNA pol I.
Nicks komen elkaar tegen → breken DNA molecule (korte
gelabelde fragmenten)
Fill-in end labeling:
Restrictiedigest met EcoRI
→ sticky end aan 5’ kant (overhang aan beide 5’ kanten
DNA polymerase → Klenow= fragment van DNA polymerase I
5’-3’ polymerase en 3’-5’ exonuclease → proofreading
Vorming korte gelabelde fragmenten
Random priming:
dsDNA denatureren tot ssDNA
Vorming willekeurige hexameren (stukjes van 6 nt lang)
Rest invullen door DNA polymerase I en gelabelde
dNTP’s (gebruik van Klenow)
Vorming korte gelabelde fragmenten
1.2.2.2 Detectie van labels
Autoradiografie/ scintillatieteller (#desintegrans per minuut)
RA
→ hoe meer radionucliden, hoe sterker signaal
Fluorochromen Licht van welbepaalde golflengte
Haptenen Via hapteen-specifiek AL + reportmolecule
Enzymen Detecteerbaar substraat toevoegen
Chemiluminescentie Lichtreacties tgv chemische reacties
1.2.2.2.1 Substraten
Alkalische MUP (methylumbelliferyl fosfaat) ⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑎𝑠𝑒 methylumbelliferon
fosfatase pNNP (paranitrofenyl fosfaat) ⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑎𝑠𝑒 paranitrofenol (spectro)
TMB (tetramethylbenzidine) ⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
𝐻202 + 𝑝𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒 gekleurd
Peroxidase
OPD (o-fenyleendiamine dihydrochloride) product (spectro)
− 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒 galactose
⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
-galactosidase X-gal
(kleurloos) en imine (blauw)
AD Gentechnologie 3
, 1.2.2.3 Stappen in het hybridisatieproces
1. Denaturatie:
= Temperatuursverhoging, pH-extremen of denaturerende stoffen verbreken baseparen van dsDNA
en zorgen voor de vorming van twee lineaire ssDNA moleculen.
Tm (=smeltemperatuur, T waarbij helft van de basen niet meer gepaard is) hangt af van:
- DNA lengte
- Samenstelling: GC (lineair verband tussen GC en Tm)
RNA: haarspeldlussen → verdwijnen bij verhitting. Tm lager dan bij DNA.
2. Pre-hybridisatie:
= compleet hybridisatiemengsel, maar zonder probe en een overmaat aan niet-specifiek DNA.
→ blokkeren van aspecifieke bindingsplaatsen, zodat probe hier niet meer kan binden
3. Hybridisatie:
= bijzondere vorm van renaturatie waarbij een gelabeld, exogeen complementair NZ bindt aan
target-sequentie.
Voorkeursbinding probe aan target tov oorspronkelijk DNA, want:
- Paren grotere stukken DNA duurt langer
- Overmaat probe → verhoogt kans op hybridisatie
Mismatching/ false annealing= verhinderen dat er aspecifieke binding is aan gelijksoortige, maar niet
identieke sequanties.
Stringentie (reactiecondities):
- Ionensterkte
- Concentratie formamide
- GC gehalte probe
- Lengte probe
- Temperatuur
4. Verwijdering niet-gebonden probe (wassen):
5. Dissociatie van niet specifieke kruishybridisatie (wassen):
- Zoutconcentratie
- pH
- Temperatuur
- Formamideconcentratie
1.2.2.4 Hybridisatiemethoden
Probe toevoegen aan reactiemengsel → hybridisatie in oplossing →
Hybridisatie in oplossing
niet-gebonden probe enzymatisch afgebroken
Binding DNA/RNA aan membraan van nitrocellulose of nylon
NZ binden door verhitting (80°C) of UV bestraling
Filterhybridisatie (blotting) Denaturatie met NaOH
Membraan bezet met EW-rijke buffer → aspecifieke hybridisatie van
probe aan membraan voorkomen = blocking
Rechtstreekse hybridisatie Target materiaal op membraan → probe erop hybridiseren
Omgekeerde hybridisatie Probe (vaste fase) geïmmobiliseerd → target erover
AD Gentechnologie 4
1.1 DNA en RNA isolatie
mRNA met poly(A)-staart aan 3’ eind → isolatie via poly(T)-oligonucleotide mbv magnetische beads.
Rnase (exonuclease die RNA kapot maakt) vrij werken
Waterfase → RNA
Interfase → gedenatureerde EW + genomisch DNA
Organische fase → EW + lipiden
Neerslaan RNA als pellet door isopropanol preciptatie
RNA gelelektroforese:
1 en 2: intact RNA met 28S:18S rRNA (ribosomaal RNA) ratio van 2:1
3: gedegradeerd RNA met smeer onder 28S en 18S
4: RNA degradatie → verlies van 28s + opstapeling gedegradeerd
RNA onderaan gel
5: RNA met contaminatie van genomisch DNA
28S/18S= grote/kleine ribosomale subeenheid
DNA isoleren door denaturatie (mbv zouten) en extractie:
- Adsorptie van silicaatdeeltjes
- Filtratie over semi-permeabele membraan waaraan DNA blijft plakken dmv chaotrope stof
Detectie:
- UV-absorptie bij 260 nm (EW 280 nm)
- OD ratio 260nm/280nm → 1,8 – 2,0 → zuiver
1.2 DNA detectie
1.2.1 Elektroforese
1.2.1.1 Gel-elektroforese
Negatief geladen fosfaatgroepen → nucleïnezuren bij neutrale pH naar positieve pool
Agarose/ polyacrylamide matrices → hoe hoger C, hoe moeilijker NZ in agarosegel migreren
Kleurstoffen:
- Ethidiumbromide: carcinogeen → alternatief: SYBR Green
- SYBR Green/ SYBR Safe:
o Intercalerend (mogelijk mutageen)
o Cytotoxisch (penetreert cellen)
1.2.1.2 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE)
Scheiding van grote DNA fragmenten
Wisselend elektrisch veld
Kleine moleculen passen zich sneller aan dan grote → netto mobiliteit tussen beide verschilt
Langdurig proces (2 tot 7 dagen)
Elektrisch veld staat onder een hoek van 45°C op de
migratierichting. Veld wisselt telkens van richting.
Paarse pijl: migratierichting
AD Gentechnologie 1
,1.2.2 Hybridisatie
Detectie van DNA/RNA target met een probe (= kort stukje ssDNA, gemerkt, complementair aan
target)
Waar:
- In oplossing
- Op vaste darge
- FISH: Fluorescente In Situ Hybridisatie: op cellen of weefsels
Hybridisatie Complementaire DNA/RNA strengen vormen H-bruggen
Denatureren/ smelten Breken van H-bruggen die twee strengen bij elkaar houden
a. Vermeerdering DNA
b. Merken van probe-DNA met hapteen of fluorescent
molecule
c. Denaturatie probe door koken/ pH veranderen.
Doelsequentie gedenatureerd
d. Hybridisatie van probe op DNA.
Probe en doelsequentie met zichzelf renatureren
e. Wassen voor verwijderen niet-gebonden probe.
Merker detecteren:
- hapteen herkend door AL die merker draagt.
- fluorescente molecule meten met juiste golflengte.
1.2.2.1 DNA probes
Specifieke probes voor:
- MO
- Oncogenen (gen dat wij allemaal hebben, potentiaal gevaarlijk gen om cellen te groeien)
- Tumorsuppressor genen (P53)
- Gemuteerd humaan DNA/ uniek humaan DNA
Labelen met:
- Radionucleotiden (35S, 3H)
- Fluorochromen (Cy3)
- Hapteen (biotine)
- Immunogene groepen
- Enzymen (alkalische fosfatase, peroxidase)
1.2.2.1.1 Bereiding
1. Aanmaak grote hoeveelheden DNA of RNA
2. Labeling (tijdens of na synthese)
Met PCR: dsDNA bereiden → labeling door gemerkte dNTP’s
Probes te lang → via recombinant-DNA technieken
1.2.2.1.2 Labeling
3’ eind met TdT:
Toevoegen van gelabelde nucleotiden aan 3’-uiteinde
van ssDNA mbv TdT (= terminaal
deoxynucleotidyltransferase)
AD Gentechnologie 2
,5’-eind:
Fosfaat verwijderen met fosfatase (CIP)
Hydroxylgroep op plek van vroegere fosfaatgroep
Fosfatase remover reagens toevoegen (fenolextractie)
Centrifugeren
Fosfaatgroep terug toevoegen met kinase
Molecule is gelabeld
Nick-translatie:
Nicks/gaten gemaakt met DNase I (endonuclease)
Polymerase I maakt streng opnieuw aan vanaf 3’ OH met
gelabelde nucleotiden
Gap verplaatst door afbraak bestaande streng door 5’-3’
exonuclease activiteit van DNA pol I.
Nicks komen elkaar tegen → breken DNA molecule (korte
gelabelde fragmenten)
Fill-in end labeling:
Restrictiedigest met EcoRI
→ sticky end aan 5’ kant (overhang aan beide 5’ kanten
DNA polymerase → Klenow= fragment van DNA polymerase I
5’-3’ polymerase en 3’-5’ exonuclease → proofreading
Vorming korte gelabelde fragmenten
Random priming:
dsDNA denatureren tot ssDNA
Vorming willekeurige hexameren (stukjes van 6 nt lang)
Rest invullen door DNA polymerase I en gelabelde
dNTP’s (gebruik van Klenow)
Vorming korte gelabelde fragmenten
1.2.2.2 Detectie van labels
Autoradiografie/ scintillatieteller (#desintegrans per minuut)
RA
→ hoe meer radionucliden, hoe sterker signaal
Fluorochromen Licht van welbepaalde golflengte
Haptenen Via hapteen-specifiek AL + reportmolecule
Enzymen Detecteerbaar substraat toevoegen
Chemiluminescentie Lichtreacties tgv chemische reacties
1.2.2.2.1 Substraten
Alkalische MUP (methylumbelliferyl fosfaat) ⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑎𝑠𝑒 methylumbelliferon
fosfatase pNNP (paranitrofenyl fosfaat) ⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑎𝑠𝑒 paranitrofenol (spectro)
TMB (tetramethylbenzidine) ⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
𝐻202 + 𝑝𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒 gekleurd
Peroxidase
OPD (o-fenyleendiamine dihydrochloride) product (spectro)
− 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒 galactose
⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
-galactosidase X-gal
(kleurloos) en imine (blauw)
AD Gentechnologie 3
, 1.2.2.3 Stappen in het hybridisatieproces
1. Denaturatie:
= Temperatuursverhoging, pH-extremen of denaturerende stoffen verbreken baseparen van dsDNA
en zorgen voor de vorming van twee lineaire ssDNA moleculen.
Tm (=smeltemperatuur, T waarbij helft van de basen niet meer gepaard is) hangt af van:
- DNA lengte
- Samenstelling: GC (lineair verband tussen GC en Tm)
RNA: haarspeldlussen → verdwijnen bij verhitting. Tm lager dan bij DNA.
2. Pre-hybridisatie:
= compleet hybridisatiemengsel, maar zonder probe en een overmaat aan niet-specifiek DNA.
→ blokkeren van aspecifieke bindingsplaatsen, zodat probe hier niet meer kan binden
3. Hybridisatie:
= bijzondere vorm van renaturatie waarbij een gelabeld, exogeen complementair NZ bindt aan
target-sequentie.
Voorkeursbinding probe aan target tov oorspronkelijk DNA, want:
- Paren grotere stukken DNA duurt langer
- Overmaat probe → verhoogt kans op hybridisatie
Mismatching/ false annealing= verhinderen dat er aspecifieke binding is aan gelijksoortige, maar niet
identieke sequanties.
Stringentie (reactiecondities):
- Ionensterkte
- Concentratie formamide
- GC gehalte probe
- Lengte probe
- Temperatuur
4. Verwijdering niet-gebonden probe (wassen):
5. Dissociatie van niet specifieke kruishybridisatie (wassen):
- Zoutconcentratie
- pH
- Temperatuur
- Formamideconcentratie
1.2.2.4 Hybridisatiemethoden
Probe toevoegen aan reactiemengsel → hybridisatie in oplossing →
Hybridisatie in oplossing
niet-gebonden probe enzymatisch afgebroken
Binding DNA/RNA aan membraan van nitrocellulose of nylon
NZ binden door verhitting (80°C) of UV bestraling
Filterhybridisatie (blotting) Denaturatie met NaOH
Membraan bezet met EW-rijke buffer → aspecifieke hybridisatie van
probe aan membraan voorkomen = blocking
Rechtstreekse hybridisatie Target materiaal op membraan → probe erop hybridiseren
Omgekeerde hybridisatie Probe (vaste fase) geïmmobiliseerd → target erover
AD Gentechnologie 4
