Samenvatting DNA Technologie – P4 – BMO2
Lab-on-a-chip apparaat dat verschillende lab functies op een enkele chip
integreert. Zeer kleine vloeistofvolumes zijn nodig om analyses uit te voren.
Gebruikt capillaire elektroforese om DNA en RNA te scheiden op molecuul
gewicht.
Gelelektroforese Techniek die wordt gebruikt om DNA, RNA en eiwitten te
scheiden op basis van grootte en lading door ze door een gelmatrix te laten
migreren onder invloed van een elektrisch veld.
Moleculen verplaatsen zich van – pool naar + pool
Agarose polysaccharide waar poriegrootte kan worden aangepast door
concentratie agarose in de gel te veranderen.
Polyacrylamide scheiden van kleinere DNA-fragmenten, gemaakt uit
acrylamide die covalent verbonden zijn via crosslinks
Smeer Patroon waar fragmenten niet als afzonderlijke banden
verschijnen, maar als vlek over de gel. Ontstaat door fragmenten va veel
verschillende lengtes.
o Niet duidelijk hoeveel fragmenten aanwezig zijn.
Formaldehyde verminderd de afbraak van RNA (inactiveerd RNAses) en
verwijderen van secundaire structuur.
In combinatie met agarose.
Bepaalde temperatuur en pH nodig voor de stabilisatie van je RNA
fragmenten.
Ribosomale RNA (rRNA) rRNA genen coderen voor 28S, 18S, 5,8S en 5S
ribosomale RNAs, wat structurele componenten van eukaryote ribosomen zijn.
80-85% zijn 28S en 18S van het totale RNA op gel zichtbaar als
fragment.
o Afbraak van RNAase dan worden 28S en 18S rRNA banden minder
scherp op gel en fluoresceren minder intens.
15% zijn kleine RNAs tRNAs, snRNA (small nuclear RNA) en microRNAs.
1-5% is mRNA dat als een vage smeer op de achtergrond zichtbaar is.
Blotting
Southern Blotting (DNA) Techniek om specifieke DNA-
sequenties in een complex mengsel te identificeren en
analyseren, waarbij DNA wordt overgedragen naar een
vaste ondergrond (membraan).
Probe gelabeld enkelstrengs complementair
DNA- fragment van doelwitgen, waardoor
specifieke fragmenten zichtbaar worden.
Hybridisatie proces waarbij complementaire
nucleïnezuren binden tot dubbelstrengs structuur
dmv basenparing. A is voor de blot. B is na de
DNA fragmenten worden gescheiden door blot, waarbij specifieke
fragmenten in het membraan
gelelektroforese en overgebracht naar membraan zijn gedetecteerd.
> DNA enkelstrengs zodat het kan hybridiseren.
Op membraan hybridiseert het enkelstrengs DNA met een probe, waardoor
dubbelstrengs DNA-hybride wordt gevormd.
Door label op probe te detecteren, worden DNA-fragmenten zichtbaar die
complementair zijn aan probe > bepalen specifieke aanwezigheid en
positie van doelwit DNA
,Methode Southern blotting:
1. Scheiding van DNA fragmenten dmv gelelektroforese
2. Gel wordt geweekt in 0,25M HCl breekt het DNA, kleine fragmenten
blotten beter.
3. Denaturatie 0,4M NaOH fosfaat groepen en basen worden
gedeprotoneerd, waardoor negatieve ladingen toenemen. Het DNA stoot
elkaar af en wordt enkelstrengs.
4. Neutralisatie met hoog zout buffer (10x SSC) voorkomt binding aan de
gel.
5. Transfer van DNA naar membraan in
20x SSC
6. Pre-Incubeer in hybridisatie buffer.
7. Voeg probe toe complementair aan
enkelstengs DNA
8. Incubeer bij geschikte temperatuur en
ion-sterkte.
9. Was ongebonden probe weg en
detecteer de hybride probe-target
sequentie.
Northern Blotting (RNA) Techniek om specifieke RNA- sequenties in
een complex mengsel te identificeren en analyseren, waarbij RNA wordt
overgedragen naar een vaste ondergrond (membraan).
RNA verhit bij 65 °C wordt het enkelstrengs.
mRNA wordt gemengd met beads (magnetisch) waaraan primers met
de sequentie TTTTTTTTTTTTTTT (oligo-dT) gebonden zijn, kan de polyA-
staart van het mRNA hybridiseren met de oligo-dT.
o Zuiver en geconcentreerd mRNA-monster dat op blot sterk
hybridisatiesignaal zal geven met probe. Beads waar primers met
RNA-moleculen zoals rRNA, tRNA en microRNA hebben oligo-dT gebonden zijn, kan
geen polyA-staart en binden niet aan primers. hybridiseren aan de polyA-
staart van mRNA
Western Blotting (Eiwit) Techniek om specifieke eiwitten in een complex
mengsel te identificeren en analyseren, waarbij eiwitten
worden overgedragen naar een vaste ondergrond
(membraan).
Specifiek antilichaam voor detectie eiwit fungeert als
probe.
Polyclonaal antilichaam detecteert meerdere
eiwitten die soortgelijke structuur delen met het
antigeen.
Monoklonaal antiserum Specifiek voor enkel het
epitoop type van het doelwit eiwit.
Specifiek eiwit zal niet altijd zichtbaar zijn als fragment op gel, maar zal
zichtbaar worden tijdens blot.
South-Western Blotting Techniek om specifieke DNA-bindende eiwitten in een
complex mengsel te identificeren en analyseren.
Dubbelstrengs DNA wordt als probe gebruikt op een eiwit blot.
Analyseren welk DNA er aan een eiwit gebonden zit.
Methode Doel Probe
, Southern blot DNA Nucleïne zuur
Northern blot RNA Nucleïne zuur
Western blot Eiwit Eiwit
South-Western blot Eiwit DNA
Lab-on-a-chip apparaat dat verschillende lab functies op een enkele chip
integreert. Zeer kleine vloeistofvolumes zijn nodig om analyses uit te voren.
Gebruikt capillaire elektroforese om DNA en RNA te scheiden op molecuul
gewicht.
Gelelektroforese Techniek die wordt gebruikt om DNA, RNA en eiwitten te
scheiden op basis van grootte en lading door ze door een gelmatrix te laten
migreren onder invloed van een elektrisch veld.
Moleculen verplaatsen zich van – pool naar + pool
Agarose polysaccharide waar poriegrootte kan worden aangepast door
concentratie agarose in de gel te veranderen.
Polyacrylamide scheiden van kleinere DNA-fragmenten, gemaakt uit
acrylamide die covalent verbonden zijn via crosslinks
Smeer Patroon waar fragmenten niet als afzonderlijke banden
verschijnen, maar als vlek over de gel. Ontstaat door fragmenten va veel
verschillende lengtes.
o Niet duidelijk hoeveel fragmenten aanwezig zijn.
Formaldehyde verminderd de afbraak van RNA (inactiveerd RNAses) en
verwijderen van secundaire structuur.
In combinatie met agarose.
Bepaalde temperatuur en pH nodig voor de stabilisatie van je RNA
fragmenten.
Ribosomale RNA (rRNA) rRNA genen coderen voor 28S, 18S, 5,8S en 5S
ribosomale RNAs, wat structurele componenten van eukaryote ribosomen zijn.
80-85% zijn 28S en 18S van het totale RNA op gel zichtbaar als
fragment.
o Afbraak van RNAase dan worden 28S en 18S rRNA banden minder
scherp op gel en fluoresceren minder intens.
15% zijn kleine RNAs tRNAs, snRNA (small nuclear RNA) en microRNAs.
1-5% is mRNA dat als een vage smeer op de achtergrond zichtbaar is.
Blotting
Southern Blotting (DNA) Techniek om specifieke DNA-
sequenties in een complex mengsel te identificeren en
analyseren, waarbij DNA wordt overgedragen naar een
vaste ondergrond (membraan).
Probe gelabeld enkelstrengs complementair
DNA- fragment van doelwitgen, waardoor
specifieke fragmenten zichtbaar worden.
Hybridisatie proces waarbij complementaire
nucleïnezuren binden tot dubbelstrengs structuur
dmv basenparing. A is voor de blot. B is na de
DNA fragmenten worden gescheiden door blot, waarbij specifieke
fragmenten in het membraan
gelelektroforese en overgebracht naar membraan zijn gedetecteerd.
> DNA enkelstrengs zodat het kan hybridiseren.
Op membraan hybridiseert het enkelstrengs DNA met een probe, waardoor
dubbelstrengs DNA-hybride wordt gevormd.
Door label op probe te detecteren, worden DNA-fragmenten zichtbaar die
complementair zijn aan probe > bepalen specifieke aanwezigheid en
positie van doelwit DNA
,Methode Southern blotting:
1. Scheiding van DNA fragmenten dmv gelelektroforese
2. Gel wordt geweekt in 0,25M HCl breekt het DNA, kleine fragmenten
blotten beter.
3. Denaturatie 0,4M NaOH fosfaat groepen en basen worden
gedeprotoneerd, waardoor negatieve ladingen toenemen. Het DNA stoot
elkaar af en wordt enkelstrengs.
4. Neutralisatie met hoog zout buffer (10x SSC) voorkomt binding aan de
gel.
5. Transfer van DNA naar membraan in
20x SSC
6. Pre-Incubeer in hybridisatie buffer.
7. Voeg probe toe complementair aan
enkelstengs DNA
8. Incubeer bij geschikte temperatuur en
ion-sterkte.
9. Was ongebonden probe weg en
detecteer de hybride probe-target
sequentie.
Northern Blotting (RNA) Techniek om specifieke RNA- sequenties in
een complex mengsel te identificeren en analyseren, waarbij RNA wordt
overgedragen naar een vaste ondergrond (membraan).
RNA verhit bij 65 °C wordt het enkelstrengs.
mRNA wordt gemengd met beads (magnetisch) waaraan primers met
de sequentie TTTTTTTTTTTTTTT (oligo-dT) gebonden zijn, kan de polyA-
staart van het mRNA hybridiseren met de oligo-dT.
o Zuiver en geconcentreerd mRNA-monster dat op blot sterk
hybridisatiesignaal zal geven met probe. Beads waar primers met
RNA-moleculen zoals rRNA, tRNA en microRNA hebben oligo-dT gebonden zijn, kan
geen polyA-staart en binden niet aan primers. hybridiseren aan de polyA-
staart van mRNA
Western Blotting (Eiwit) Techniek om specifieke eiwitten in een complex
mengsel te identificeren en analyseren, waarbij eiwitten
worden overgedragen naar een vaste ondergrond
(membraan).
Specifiek antilichaam voor detectie eiwit fungeert als
probe.
Polyclonaal antilichaam detecteert meerdere
eiwitten die soortgelijke structuur delen met het
antigeen.
Monoklonaal antiserum Specifiek voor enkel het
epitoop type van het doelwit eiwit.
Specifiek eiwit zal niet altijd zichtbaar zijn als fragment op gel, maar zal
zichtbaar worden tijdens blot.
South-Western Blotting Techniek om specifieke DNA-bindende eiwitten in een
complex mengsel te identificeren en analyseren.
Dubbelstrengs DNA wordt als probe gebruikt op een eiwit blot.
Analyseren welk DNA er aan een eiwit gebonden zit.
Methode Doel Probe
, Southern blot DNA Nucleïne zuur
Northern blot RNA Nucleïne zuur
Western blot Eiwit Eiwit
South-Western blot Eiwit DNA
