DNA-contaminatie verwijderen uit RNA-monsters
Contaminatie van RNA-monsters met DNA kan problematisch zijn, vooral bij toepassingen zoals RT-qPCR. De
volgende stappen worden vaak gevolgd om DNA te verwijderen:
1. DNAse-behandeling:
Toevoegen DNAse om het DNA specifiek af te breken.
Hitte activatie: 20 min op 37 °C
Toevoegen: EDTA om DNAse te inactiveren: 10 min op 65°C
2. Stoppen van de DNAse-reactie:
Gebruik EDTA om de DNAse-activiteit te stoppen (door Mg²⁺ te cheleren) en verwarm kort tot 65-70 °C om het
enzym te inactiveren.
3. RNA-opzuivering:
Zuiver RNA na DNAse-behandeling opnieuw met bijvoorbeeld een silica-kolom of organische extractie (zoals
met fenol/chloroform) om enzymresten te verwijderen.
EDTA en RNAse/DNAse-inhibitie
EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) is een cheleermiddel dat metaalionen zoals Mg²⁺ en Ca²⁺ bindt.
• RNAse (ribonuclease): EDTA inhibeert RNAse niet, omdat RNAse geen metaalionen als cofactor
gebruikt. Het blijft actief en kan RNA afbreken.
• DNAse (deoxyribonuclease): EDTA kan DNAse inhiberen door Mg²⁺ te cheleren, wat nodig is voor de
activiteit van DNAse. Hierdoor stopt EDTA de werking van DNAse.
,RNA-extractie: Lyseren, isoleren en oplossen
RNA-extractie omvat drie belangrijke stappen:
1. Lyseren:
De celwand en -membraan afbreken en RNA vrijkrijgen
Methoden zoals vortexen, homogeniseren, detergenten, vriezen en ontdooien of sonificatie
2. Isoleren:
Na lysis wordt RNA gescheiden van DNA, eiwitten en andere celcomponenten.
Organische extractie (Trizol): guanidium-thiocyanaat-phenol-chloroform extractie, centrifugeer en
scheid de waterige (RNA) laag van de organische en intermediaire lagen. Waterlaag = RNA,
Intermediaire laag = DNA en onderste laag = eiwitten en lipiden.
DNA-extractie = Phenol = ph7
RNA-extractie = Trizol =ph4 (laat DNA neerlsaan zodat er geen DNA-contaminatie vormt)
Kolomchromatografie: RNA bindt aan een silica-membraan in een kolom in de aanwezigheid van
chaotrope zouten. Was RNA meerdere keren om onzuiverheden te verwijderen.
Alcoholprecipitatie van RNA = RNA concentreren of opzuiveren
1. Voeg natriumacetaat toe zodat ionen de negatieve lading (fosfaatgroep) neutraliseren = neerslaan
2. Voeg ethanol of isopropanol toe om de oplosbaarheid van RNA te verminderen = aggregatenvorming
3. Centrifugeer bij hoge snelheid om het RNA-pellet te verzamelen.
5. Was het pellet met ethanol, droog kort en los op in RNAse-vrij water.
Kolomchromatografie
1. Silica-kolommen:
Lyseer – bind – was – elueer
RNA bindt aan silica in de aanwezigheid van chaotrope zouten zoals guanidine-isothiocyanaat.
Niet-gebonden stoffen worden weggespoeld met buffers.
RNA wordt vervolgens elueerd met RNAse-vrij water of een elutiebuffer.
2. Automatisering met beads:
RNA bindt aan magnetische beads gecoat met een materiaal dat vergelijkbaar is met silica.
De beads worden gescheiden met behulp van een magnetisch veld.
Automatische robots kunnen deze stappen uitvoeren, wat consistentie en tijdsbesparing oplevert.
3. Oplossen:
Los het RNA op in RNAse-vrij water/TE-buffer. Zorg dat de pH neutraal is om degradatie te voorkomen.
RNA concentreren
Alcoholprecipitatie
Silica-kolom
Centrifugaalconcentrator
SpeedVac
,RNA-kwantificatie
Het bepalen van RNA-kwaliteit en -concentratie is essentieel.
1. Spectrofotometrie:
Meet RNA-absorptie bij 260 nm (A260).
De verhouding A260/A280 geeft een indicatie van eiwitverontreiniging:
Ideale ratio: 2.0 voor puur RNA. (bij DNA 1.8)
A260/A230 verhouding geeft informatie over contaminanten zoals zout en fenol.
2. Fluorimetrie:
Gebruikt RNA-specifieke fluorescente kleurstoffen.
Veel gevoeliger dan spectrofotometrie en detecteert RNA met hogere nauwkeurigheid.
3. Elektroforese:
Agarose-gel: Controleer RNA-integriteit door visueel de 18S- en 28S-rRNA-banden te inspecteren.
Capillaire elektroforese: Geeft een RNA Integrity Number (RIN) om de kwaliteit te kwantificeren.
Ideaal RIN voor toepassingen zoals RNA-seq: ≥ 7. (10 = beste score) (zie pieken)
Met deze stappen en technieken kun je RNA van hoge kwaliteit extraheren, zuiveren, kwantificeren en
concentreren voor downstream-toepassingen zoals RT-PCR, RNA-sequencing of microarray-analyses.
RNA In Vitro Transcriptie
RNA in vitro transcriptie is een methode om RNA kunstmatig te maken in het laboratorium. Hierbij wordt een
DNA-template gebruikt dat een specifieke promotor bevat (zoals T7, SP6 of T3). Een RNA-polymerase leest dit
DNA af en zet het om in RNA, net zoals het in cellen gebeurt.
Het proces begint met een geschikt DNA-template, meestal lineair DNA dat makkelijker wordt afgelezen door
het RNA-polymerase. In een reactieoplossing worden vier bouwstenen (nucleotiden: ATP, GTP, CTP, en UTP)
toegevoegd samen met een buffer die belangrijke cofactoren zoals magnesium bevat. Het RNA-polymerase
bouwt het RNA op door de nucleotiden in een specifieke volgorde aan elkaar te koppelen op basis van de DNA-
sequentie.
Na de reactie, die ongeveer 1 tot 2 uur duurt, wordt het DNA-template verwijderd met een enzym (DNAse I),
zodat alleen RNA overblijft. Het RNA wordt vervolgens gezuiverd om verontreinigingen te verwijderen.
Hiervoor kunnen methoden zoals fenol/chloroform-extractie of kolomchromatografie worden gebruikt.
Controle: Na de synthese wordt de kwaliteit en hoeveelheid RNA gecontroleerd. De integriteit van het RNA kan
worden bekeken met agarose-elektroforese, terwijl de concentratie kan worden gemeten met een
spectrofotometer zoals een NanoDrop.
Variaties: In sommige gevallen kan het RNA worden aangepast met gemodificeerde nucleotiden, zoals
pseudouridine, om het stabieler te maken. Voor specifieke toepassingen, zoals mRNA-vaccins, kan een 5’-cap
worden toegevoegd om het RNA te beschermen en efficiënter te laten functioneren in cellen.
Beide strengen kunnen template of matrijs zijn, afhankelijk van de positie van de promotor!
, Reverse transcriptie
Reverse transcriptie is een methode waarbij RNA wordt omgezet in complementair DNA (cDNA) met behulp
van een enzym genaamd reverse transcriptase. Dit proces bootst de manier na waarop retrovirussen, zoals HIV,
hun RNA-genoom omzetten in DNA. In het laboratorium wordt deze techniek gebruikt om RNA te analyseren,
omdat DNA stabieler is en gemakkelijker te manipuleren.
Het proces begint met een RNA-template dat wordt gebruikt om een cDNA-streng te maken. Hiervoor is een
primer nodig die aan het RNA bindt, zodat reverse transcriptase kan beginnen met het synthetiseren van cDNA.
Er zijn drie soorten primers die vaak worden gebruikt:
Oligo(dT)-primers: Binden aan de poly(A)-staart van mRNA en zijn specifiek voor mRNA-transcripten.
Random hexameren: Korte willekeurige sequenties die aan elk RNA kunnen binden.
Gen-specifieke primers: Gericht op een specifieke sequentie binnen het RNA.
Een mengsel van het RNA, de primer, dNTP’s (bouwstenen voor DNA), en reverse transcriptase wordt
geïncubeerd bij een geschikte temperatuur. Het enzym synthetiseert een cDNA-streng die complementair is
aan het RNA-template.
Na de synthese van de cDNA-streng kan het RNA-template optioneel worden afgebroken met een enzym
genaamd RNAse H, zodat alleen het enkelstrengs cDNA overblijft. Dit cDNA kan vervolgens worden gebruikt in
experimenten zoals PCR, waarbij het DNA wordt vermenigvuldigd om de expressie van specifieke genen te
meten.
Waarom is reverse transcriptie nuttig? RNA is instabiel en wordt snel afgebroken door enzymen (RNAsen). Door
RNA om te zetten in cDNA, kun je het bestuderen en analyseren zonder dat het materiaal verloren gaat.
Vier methoden van cDNA-synthese
1. Blunt-End Synthese
Het cDNA wordt gesynthetiseerd zonder overhangende uiteinden of extra modificaties. Dit resulteert in
dubbelstrengs DNA met stompe uiteinden.
Nadelen: Niet directioneel
2. Directionele Synthese
Tijdens de cDNA-synthese worden specifieke adapters of overhangende uiteinden toegevoegd om de richting
van het cDNA te behouden. Vaak wordt dit bereikt door gebruik van gemodificeerde primers of enzymatische
ligatie.
Voordelen: Directioneel en primers met extra adaptor voor restricitie-sites
3. Ligatie-Onafhankelijke Synthese
cDNA wordt gesynthetiseerd zonder enzymatische ligatie van adapters of vectoren. Dit wordt gedaan mbv
specifieke sequenties aan primers die rechtstreeks complementair zijn aan de kloneringsvector. (TdT)
Voordelen: eenvoudig, geen RE en liga’s nodig
Nadelen: niet directioneel
4. Gen-Specifieke Synthese
Een primer die specifiek bindt aan een doelwit-gen wordt gebruikt om alleen het RNA van dat gen te
transcriberen.
Voordelen: Directioneel en primers met extra adaptor voor restricitie-sites
Contaminatie van RNA-monsters met DNA kan problematisch zijn, vooral bij toepassingen zoals RT-qPCR. De
volgende stappen worden vaak gevolgd om DNA te verwijderen:
1. DNAse-behandeling:
Toevoegen DNAse om het DNA specifiek af te breken.
Hitte activatie: 20 min op 37 °C
Toevoegen: EDTA om DNAse te inactiveren: 10 min op 65°C
2. Stoppen van de DNAse-reactie:
Gebruik EDTA om de DNAse-activiteit te stoppen (door Mg²⁺ te cheleren) en verwarm kort tot 65-70 °C om het
enzym te inactiveren.
3. RNA-opzuivering:
Zuiver RNA na DNAse-behandeling opnieuw met bijvoorbeeld een silica-kolom of organische extractie (zoals
met fenol/chloroform) om enzymresten te verwijderen.
EDTA en RNAse/DNAse-inhibitie
EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) is een cheleermiddel dat metaalionen zoals Mg²⁺ en Ca²⁺ bindt.
• RNAse (ribonuclease): EDTA inhibeert RNAse niet, omdat RNAse geen metaalionen als cofactor
gebruikt. Het blijft actief en kan RNA afbreken.
• DNAse (deoxyribonuclease): EDTA kan DNAse inhiberen door Mg²⁺ te cheleren, wat nodig is voor de
activiteit van DNAse. Hierdoor stopt EDTA de werking van DNAse.
,RNA-extractie: Lyseren, isoleren en oplossen
RNA-extractie omvat drie belangrijke stappen:
1. Lyseren:
De celwand en -membraan afbreken en RNA vrijkrijgen
Methoden zoals vortexen, homogeniseren, detergenten, vriezen en ontdooien of sonificatie
2. Isoleren:
Na lysis wordt RNA gescheiden van DNA, eiwitten en andere celcomponenten.
Organische extractie (Trizol): guanidium-thiocyanaat-phenol-chloroform extractie, centrifugeer en
scheid de waterige (RNA) laag van de organische en intermediaire lagen. Waterlaag = RNA,
Intermediaire laag = DNA en onderste laag = eiwitten en lipiden.
DNA-extractie = Phenol = ph7
RNA-extractie = Trizol =ph4 (laat DNA neerlsaan zodat er geen DNA-contaminatie vormt)
Kolomchromatografie: RNA bindt aan een silica-membraan in een kolom in de aanwezigheid van
chaotrope zouten. Was RNA meerdere keren om onzuiverheden te verwijderen.
Alcoholprecipitatie van RNA = RNA concentreren of opzuiveren
1. Voeg natriumacetaat toe zodat ionen de negatieve lading (fosfaatgroep) neutraliseren = neerslaan
2. Voeg ethanol of isopropanol toe om de oplosbaarheid van RNA te verminderen = aggregatenvorming
3. Centrifugeer bij hoge snelheid om het RNA-pellet te verzamelen.
5. Was het pellet met ethanol, droog kort en los op in RNAse-vrij water.
Kolomchromatografie
1. Silica-kolommen:
Lyseer – bind – was – elueer
RNA bindt aan silica in de aanwezigheid van chaotrope zouten zoals guanidine-isothiocyanaat.
Niet-gebonden stoffen worden weggespoeld met buffers.
RNA wordt vervolgens elueerd met RNAse-vrij water of een elutiebuffer.
2. Automatisering met beads:
RNA bindt aan magnetische beads gecoat met een materiaal dat vergelijkbaar is met silica.
De beads worden gescheiden met behulp van een magnetisch veld.
Automatische robots kunnen deze stappen uitvoeren, wat consistentie en tijdsbesparing oplevert.
3. Oplossen:
Los het RNA op in RNAse-vrij water/TE-buffer. Zorg dat de pH neutraal is om degradatie te voorkomen.
RNA concentreren
Alcoholprecipitatie
Silica-kolom
Centrifugaalconcentrator
SpeedVac
,RNA-kwantificatie
Het bepalen van RNA-kwaliteit en -concentratie is essentieel.
1. Spectrofotometrie:
Meet RNA-absorptie bij 260 nm (A260).
De verhouding A260/A280 geeft een indicatie van eiwitverontreiniging:
Ideale ratio: 2.0 voor puur RNA. (bij DNA 1.8)
A260/A230 verhouding geeft informatie over contaminanten zoals zout en fenol.
2. Fluorimetrie:
Gebruikt RNA-specifieke fluorescente kleurstoffen.
Veel gevoeliger dan spectrofotometrie en detecteert RNA met hogere nauwkeurigheid.
3. Elektroforese:
Agarose-gel: Controleer RNA-integriteit door visueel de 18S- en 28S-rRNA-banden te inspecteren.
Capillaire elektroforese: Geeft een RNA Integrity Number (RIN) om de kwaliteit te kwantificeren.
Ideaal RIN voor toepassingen zoals RNA-seq: ≥ 7. (10 = beste score) (zie pieken)
Met deze stappen en technieken kun je RNA van hoge kwaliteit extraheren, zuiveren, kwantificeren en
concentreren voor downstream-toepassingen zoals RT-PCR, RNA-sequencing of microarray-analyses.
RNA In Vitro Transcriptie
RNA in vitro transcriptie is een methode om RNA kunstmatig te maken in het laboratorium. Hierbij wordt een
DNA-template gebruikt dat een specifieke promotor bevat (zoals T7, SP6 of T3). Een RNA-polymerase leest dit
DNA af en zet het om in RNA, net zoals het in cellen gebeurt.
Het proces begint met een geschikt DNA-template, meestal lineair DNA dat makkelijker wordt afgelezen door
het RNA-polymerase. In een reactieoplossing worden vier bouwstenen (nucleotiden: ATP, GTP, CTP, en UTP)
toegevoegd samen met een buffer die belangrijke cofactoren zoals magnesium bevat. Het RNA-polymerase
bouwt het RNA op door de nucleotiden in een specifieke volgorde aan elkaar te koppelen op basis van de DNA-
sequentie.
Na de reactie, die ongeveer 1 tot 2 uur duurt, wordt het DNA-template verwijderd met een enzym (DNAse I),
zodat alleen RNA overblijft. Het RNA wordt vervolgens gezuiverd om verontreinigingen te verwijderen.
Hiervoor kunnen methoden zoals fenol/chloroform-extractie of kolomchromatografie worden gebruikt.
Controle: Na de synthese wordt de kwaliteit en hoeveelheid RNA gecontroleerd. De integriteit van het RNA kan
worden bekeken met agarose-elektroforese, terwijl de concentratie kan worden gemeten met een
spectrofotometer zoals een NanoDrop.
Variaties: In sommige gevallen kan het RNA worden aangepast met gemodificeerde nucleotiden, zoals
pseudouridine, om het stabieler te maken. Voor specifieke toepassingen, zoals mRNA-vaccins, kan een 5’-cap
worden toegevoegd om het RNA te beschermen en efficiënter te laten functioneren in cellen.
Beide strengen kunnen template of matrijs zijn, afhankelijk van de positie van de promotor!
, Reverse transcriptie
Reverse transcriptie is een methode waarbij RNA wordt omgezet in complementair DNA (cDNA) met behulp
van een enzym genaamd reverse transcriptase. Dit proces bootst de manier na waarop retrovirussen, zoals HIV,
hun RNA-genoom omzetten in DNA. In het laboratorium wordt deze techniek gebruikt om RNA te analyseren,
omdat DNA stabieler is en gemakkelijker te manipuleren.
Het proces begint met een RNA-template dat wordt gebruikt om een cDNA-streng te maken. Hiervoor is een
primer nodig die aan het RNA bindt, zodat reverse transcriptase kan beginnen met het synthetiseren van cDNA.
Er zijn drie soorten primers die vaak worden gebruikt:
Oligo(dT)-primers: Binden aan de poly(A)-staart van mRNA en zijn specifiek voor mRNA-transcripten.
Random hexameren: Korte willekeurige sequenties die aan elk RNA kunnen binden.
Gen-specifieke primers: Gericht op een specifieke sequentie binnen het RNA.
Een mengsel van het RNA, de primer, dNTP’s (bouwstenen voor DNA), en reverse transcriptase wordt
geïncubeerd bij een geschikte temperatuur. Het enzym synthetiseert een cDNA-streng die complementair is
aan het RNA-template.
Na de synthese van de cDNA-streng kan het RNA-template optioneel worden afgebroken met een enzym
genaamd RNAse H, zodat alleen het enkelstrengs cDNA overblijft. Dit cDNA kan vervolgens worden gebruikt in
experimenten zoals PCR, waarbij het DNA wordt vermenigvuldigd om de expressie van specifieke genen te
meten.
Waarom is reverse transcriptie nuttig? RNA is instabiel en wordt snel afgebroken door enzymen (RNAsen). Door
RNA om te zetten in cDNA, kun je het bestuderen en analyseren zonder dat het materiaal verloren gaat.
Vier methoden van cDNA-synthese
1. Blunt-End Synthese
Het cDNA wordt gesynthetiseerd zonder overhangende uiteinden of extra modificaties. Dit resulteert in
dubbelstrengs DNA met stompe uiteinden.
Nadelen: Niet directioneel
2. Directionele Synthese
Tijdens de cDNA-synthese worden specifieke adapters of overhangende uiteinden toegevoegd om de richting
van het cDNA te behouden. Vaak wordt dit bereikt door gebruik van gemodificeerde primers of enzymatische
ligatie.
Voordelen: Directioneel en primers met extra adaptor voor restricitie-sites
3. Ligatie-Onafhankelijke Synthese
cDNA wordt gesynthetiseerd zonder enzymatische ligatie van adapters of vectoren. Dit wordt gedaan mbv
specifieke sequenties aan primers die rechtstreeks complementair zijn aan de kloneringsvector. (TdT)
Voordelen: eenvoudig, geen RE en liga’s nodig
Nadelen: niet directioneel
4. Gen-Specifieke Synthese
Een primer die specifiek bindt aan een doelwit-gen wordt gebruikt om alleen het RNA van dat gen te
transcriberen.
Voordelen: Directioneel en primers met extra adaptor voor restricitie-sites
