CELBIOLOGIE II SAMENVATTING

HOOFDSTUK 1: SORTEREN VAN EIWITTEN


In EU cellen = celorganellen
➔ Transportmechanismen nodig


1. SORTEREN NAAR MITOCHONDRIËN

- Eiwitten van oxidatieve fosforylatie gecodeerd dr mitochondriaal DNA
- Meeste mitoch. Eiwn => synthese op polyribosomen in cytosol



a. Structuur & functie mitochondriën

- Dubbel membraan
- Permeabiliteit
 Buitenste = vrij bewegen (poriën)
 Binnenste = ondoorlaatbaar (cardioplipine = speciale fosfolipiden)
- DNA van mitochondriën zijn betrokken bij oxidatieve fosforylatie
- Metabole omzettingen
 Afbraak vetzuren -> acetyl-CoA
 Afbraak glucose -> acetyl-CoA
 Krebscyclus: acetyl-CoA -> CO2 en NADH, FADH2
 Stikstofmetabolisme
 Apoptose = gerpogrammeerde celdood


b. Eiwitten bestemd vr mitochondriale matrix

Signaal aan N-term : 20-50 AZ
- Hydrofobe
- Positief geladen basische
- Gehydroxleerde

Enkel ongevouwen eiwitten worden geïmporteerd in mitochondriale matrix!!!

- Na synthese gebonden aan chaperone in cytosol
 Vb. heat shock protein 70
- Initiatie= binding signaalsequentie aan importreceptor in buitenste mitoch. Membraan
= TOM eiwit (translocon of outer membrane)
- Receptor transfereert eiwit nr importkanaal (TOM40)
 Op contactplaats tssn buitense en binnenste membraan
- Translocatie dr binnenste membraan
= TIM eiwit (translocon of inner membrane)
- N-term signaalseq bereijt mitochondriale matrix
 Afsplitsing dr protease
 Eiwit gebonden dr chaperone
 Eiwit gevouwen mbv chaperonine




1

,ENERGIE VEREIST!

1. Binding chaperone in cytosol
2. Binding aan chaperone in matrix
3. Generatie elektrochemische gradiënt over binnenste membraan = proton motive force
 Neg. Lading in matrix trekt positive signaalsequentie nr binnen


c. Eiwitten bestemd vr andere mitochondriale compartimenten

1. In buitenste membraan: eiwit tegengehouden dr TOM 40 kanaal & lateraal bewegen
2. In intermembranaire ruimte: migratie dr kanaal van TOM & komt vrij
3. In binnenste membraan: migratie dr kanaal van TOM en TIM + eiwit bevat N-term
signaalsequentie én hydrofobe sequentie
 Weerhoudt eiwit in binnenste membraan
4. In matrix & erna terug migreren nr binnenste mebraan / intermembranaire ruimte




2. SORTEREN NAAR PEROXISOMEN

= microbodies

a. Structuur

- Enkelvoudig membraan
- In alle EU cellen, behalve RBC
- Grootte & compositie afh van celtype


b. Functie

- Bevatten meerdere oxidasen: produceren H2O2
Vb. D-AZ oxidase, acyl CoA oxidase,…
- Bevatten catalase dat H2O2 inactiveert
- Lipidenmetabolisme
» -oxidatie
» -oxidatie
» Synthese etherfosfolipiden


c. Transport van eiwitten bested vr peroxisomale matrix

1. Synthese op polyribosomen in cytosol
 2 soorten signaalsequentie
PTS1 signaal: C-term
» SKL= serine-lysine-leucine wordt niet afgesplitst!
PTS2 signaal: N-term
» Kan worden afgesplitst


2

, 2. Cytosolische receptor (= Pex 5 receptor) herkent signaalsequentie & brengt eiwit nr
peroxisomaal membraan
 Brengt op eiwit in de peroxisomale membraan (= Pex 14 eiwit)
3. Translocatie door membraan
 afsplitsen van peroxisomaal matrix eiwit + recyclage receptor nr cytosol
4. eiwitten importeren in gevouwen toestand kan
5. peroxines= eiwitten betrokken in importproces
 mens : 14 pex & gist= 29 pex
6. AFHANKELIJK VAN ATP!!!



d. Transport van eiwitten vr peroxisomaal membraan

PATHOLOGIE: cerebro-hepato-renaal syndroom van Zellweger

- Hypotonie
- Dysgenese van hersengebieden Zeer lange vetzuren ↑
-
-
Psychomotorische retardie
Dysmorfie van aangezicht
Vertakte vetzuren FA ↑
- Niercysten Immature galzuren ↑
- Leverfibrose
- Dood binnen 6 maanden
Etherlipiden ↓
Oorzaak= mutatie in Pex genen
Gevolg= peroxisomale eiwitten zijn nt normaal gelocaliseerd
 In cytosol
 Enzymen zijn hier nt stabiel!!!




3. TRANSPORT NAAR EN VAN DE KERN

- Nucleaire enveloppe= veel poriën
 Nuclear pore complexes (NPC) = 100 tal eiwitten = nucleoporines
 NPC heft octaganale vorm
- Nuclear basket= 8 filamneten bijeengehouden dr een ring
 Moleculen < 60 kDa (ionen & kleine eiwitten) diffunderen hierdoor
 Grote eiwitten & ribonucleoproteïne complexen mbv eiwitten aan nucleoporines


a. Van cytosol naar kern

- Eiwitsynthese op polyribosomen in cytosol
- Eiwitten + NLS = nuclear localisatie signaal
» kort domein van basische Azn

1. NLS-eiwit gebonden dr importin eiwit
2. Complex migreert dr NPC (interactie met nucleoporines)



3

, 3. In nucleoplasma binding aan RAN-GTP = klein G proteïne
 Affiniteit van importin vr cargo verlaagt
 Eiwit komt vrij in nucleoplasma
4. Importin-Ran-GTP complex gerecycleerd nr cytosol
 GTP gehydroliseerd tot GDP dr inwerking Ran-GAP = GTPase activating protein
 Importin komt vrij in cytosol
5. Ran-GDP terug nr nucleoplasma
 Ran-GEF (= guanine nucleotide exchange factor )vervangt GDP dr GTP




b. Van kern naar cytosol


- Eiwit + NES = nuclear export signal
» Leucine rijke sequentie

1. NES-eiwit bindt met exportin + Ran-GTP
 Diffundeert dr NPC (interactie met nucleoporines)
2. Ran-GAP aan cytosolische zijde hydroliseerd RAN-GTP tot Ran-GDP
 Affiniteit vr exportin verlaagt
 Eiwit vrij in cytosol
 Ran-GDP & exportin gerecycleerd nr kern
3. Ran-GEF zet Ran-GDP om nr Ran-GTP



1-RICHTINGSTRANSPORT van en nr de kern dr de localistaie van
- Ran-GEF in kern
- Ran-GAP in cytosol

 Slecht functionerende im/export = ALS (amyotrofe lateraal sclerose)




4

,Begrip: TARGETING SIGNAAL = NOODZAKELIJK & VOLDOENDE

- Gebruik plasmiden met cDNA code vr het te importeren eiwit + code vr reportereiwit
 Localisatie id cel makkelijker bepalen vb. GFP
- Plasmiden in gekweekte cellen dr transfectie
 Aanmaak GFP-catalase fusie-eiwit
- Dr C-term. Peroxisomale signaalsequentie
 Translocatie eiwitten nr peroxisomen
 ontstaan groene punten
- Mutatie van signaal sequentie
 Fusie-eiwit blijft in cytosol achter
 Egale groene kleur
 Aangetoond dat de seq. NOODZAKELIJK is vr de correcte localisatie
- Anders: vermoedelijk signaal sequentie fusioneren met reportereiwit (vb. GFP-SKL)
 Indien juiste localisatie
 VOLDOENDE



4. DE SECRETORISCHE WEG

Eiwitten vr
- ER
- Golgi
- Lysosomen
- Plasmamembraan
- Secretie


a. Oplosbare eiwitten

Synthese op vrije polyribosomen in cytosol

- N term signaalsequentie (16-30 AZ)
- 1/+ positief gekaden AZ
- Continue stretch van 6-12 hydrofobe AZ


 Cotranslationeel import

1. Translatie op cytosolisch ribosoom = synthese signaalsequentie
2. Signaalsequentie herkend dr SRP (= signal recognition particle ) in cytosol
 SRP= RNA + 6 eiwitten
 Translatie stopt
3. SRP/signaalseq/ribosoom nr ER
 SRP bindt aan SRP receptor
 Ribosoom bindt aan translocatiekanaal in ER membraan
4. SRP splitst af & recycleert nr cytosol
 Eiwitsynthese gaat verder op RER
5. Tijdens translatie ook translocatie van eiwit door kanaal nr lumen van ER =cotranslat. Transp
6. Protease in ER membraan aan kanaal =>Splitst signaalsequentie af



5

, b. Insertie van eiwitten in membranen (ER, golgi, lysosomen, plasmamembraan)

Synthese op RER en in membraan geïntegreerd

 ORIËNTATIE BLIJFT BEHOUDEN!

- Topologie= aantal keer dat het polypeptide door de membraan gaat
(= aantal membraanspannende domeinen) & de oriëntatie tov het cytosol.
- Membraanspannend domein
 Bestaat uit 20-25 hydrofobe AZ die een -helix vormen waarbij de hydrofobe AZ gericht
zijn nr de fosfolipidendubbellaag.


TYPE I EIWITTEN

- N-term signaalsequentie
- Hydrofobe sequentie = membraanspannende -helix

 Cotranslationeel transport
- Hydrofobe sequentie in kanaal = stop translocatie
 Stop-transfer anker sequentie
- Door hydrofobiciteit lateraal bewegen in fosfolipidendubbellaag
- Rest eiwit: synthese in cytosol

C -> CYTOSOL
N -> LUMEN


TYPE II EN III EIWITTEN

- Geen N-term signaalsequentie
 Interne hydrofibe sequentie = ER signaalsequentie & membraananker sequentie

TYPE II

- Translatie start op vrij ribosoom in cytosol
- Binding interne signaalsequentie aan SRP
 Migratie complex naar ER
- Signaalsequentie bint aan translocatiekanaal zodat
N -> CYTOSOL
C -> LUMEN


TYPE III

- Signaalanker sequentie dichter bij N-term
- Bindt aan translocatiekanaal met
N -> LUMEN
C -> CYTOSOL




6