H1: algemene aspecten van virusinfecties en hun behandeling
1.1 Morfologie en classificatie van virussen
- virussen:
® kleinst gekende infectieuze deeltjes
® obligate intracellulaire deeltjes
® niet autonoom vermenigvuldigen
® uitgesproken species-specifiteit
1.1.1 Microscopie van virussen en hun cytopathogeen e?ect
- diameter v virussen = minder dan 1 µm knn met elektronenmicroscoop bekeken w
® kleinste virussen: ong 30 nm en de invloeden v virussen op cel knn wél licht-
® grootste humane virus: 400 nm microscopisch bekeken w
- cytopathogeen e?ect/CPE
= vernietiging v gastheercellen of wijziging in celmorfologie tgv virusreplicatie
ð men kan hiervr beroep doen op celculturen
1.1.2 Opbouw van viruspartikels
- viruspartikels/virions bevatten genetisch materiaal omgeven dr eiwitmantel/capside = nucleocapside
® bij sommige virussen enveloppe = lipide buitenlaag rond capside
® andere virussen geen enveloppe = naakt virus
- viraal genoom = bestaat uit RNA of DNA, ss of ds
® sommigen zeer compact genoom met overlappende genen
® anderen gebruiken alternatieve splicing mechanismen vr max verscheidenheid aan eiwitten
- capside = viraal-gecodeerde proteïnestructuur die bestaat uit repetitieve eenheden/capsomeren
® structuur: eicosahedraal of helicaal
ð complexe virussen geen v beiden
- enveloppe
(a) fosfolipide-dubbellaag
ð afkomstig v celmembraan
• w verworven wnr virussen op einde v replicatie de cel verlaten dr budding
(b) glycoproteïne uitsteeksels/peplomeren/spikes
ð viraal gecodeerd
ð structureel + immunologisch belang -> fungeren als antigen wrtegen gastheer immuniteit ontwikkelt
1.2 Virustransmissie en pathogenese
1.2.1 Transmissieroutes
- feco-oraal bv dr slechte handhygiëne
- respiratoir
- rechtstreeks contact met besmette huid, speeksel, urine, voorwerp
- seksueel
- parenteraal via besmet bloed
- verticaal (= v moeder op kind) -> prenataal (dr placenta), perinataal (geboortekanaal) of postnataal (melk)
- via besmette dieren
1
,- route w mee bepaald dr stabiliteit v het virus buiten de gastheer
® niet geënvelopeerde virussen overleven makkelijker in buitenwereld
® geënvelopeerde virussen zeer gevoelig vr uitdroging, extreme temp of extreme pH
1.2.2 Virussen overgedragen door dieren
- zoönose = infectie nr de mens overgedragen dr een gewervelde diersoort al of niet met tssnkomst v insect
- arbovirus = virus overgedragen dr arthropoden (geleedpotigen zoals insecten en teken)
1.2.3 E?iciëntie van verspreiding
- besmettelijkheid = hoe succesvol de transmissie v het virus is
® afh v versch factoren
- basisreproductiegetal R0 = hoeveel personen gem sec besmet w dr 1 prim besmette persoon in situatie wrin
populatie geen immuniteit heeft en geen maatregelen zijn getro?en om
verspreiding in te perken
1.2.4 Incubatietijd
= tijd tssn blootstelling aan het virus en de ziektesymptomen
1.2.5 Ziektebeloop in de tijd
acute infectie lysis v de geïnfecteerde cellen
-> vb rhinovirus
latente infectie virus na 1e contact verborgen in lichaam zonder replicatie, mr kan
reactiveren bij verminderde immuniteit
-> vb herpex simplex virus
chronisch persistente infectie langdurige lage-graad virusreplicatie wrbij drager continu
besmettelijk is
-> vb HIV
asymptomatische/subklinische infectie
oncogene virussen gastheercellen transformeren tot continu delende cellen en dit
leidt tot kwaadaardige tumoren
-> vb papillomavirussen
1.2.6 Immuniteit van de gastheercel
- sommige virussen genereren levenslange immuniteit bij gastheer wrdr infectie 1 malig is
® met e?iciënt vaccin een langdurige tot levenslange bescherming
- andere virussen kan elk individu meerdere keren geïnfecteerd geraken
® virus komt vr in versch serotypes of ondergaat voortdurend genetische wijziging
- meest succesvolle virussen zijn chronisch-persistent aanwezigen wegens goede wereldwijde verspreiding
® immune-evasion mechanismen
ð overleven in gastheer gegarandeerd drdat natuurlijke of adaptieve immuunrespons w omzeild
1.3 Laboratoriumdiagnostiek bij virusinfecties
- aantonen virusinfectie dr:
(1) opsporing v virus
(2) opsporing v virus-specifieke antisto?en
2
,- voordelen serologische strategieën:
® sneller, geen kweek v specimen
® antisto?en knn aangetoond w nadat het virus verdwenen is
- actuele infectie aantonen: stijging v de IgG antistoftiter dr serumpaar aantonen
® 1 serumstaal volstaat alleen bij bepaling v virus-specifieke IgM antisto?en
ð IgM vroeger na blootstelling aanwezig dan IgG
- seroconversie = geïnfecteerde persoon evolueert v seronegatief nr seropositief
- convalescentie periode = herstelperiode na acute fase
® antistoftiter eerst hoog, drna geleidelijk dalen
Diagnostische test beoordelen
- gevoeligheid - snelheid/responstijd
- specificiteit - kostprijs
1.3.1 Virusisolatie en -kweek
- gebeurt vr microscopie
in vitro celcultuur
in ovo bebroede kippeneieren
in vivo pasgeboren muizen
1.3.2 Microscopische technieken
(1) lichtmicroscopie
® obv virus-karakteristieke cytopathogeen e?ect (CPE)
(2) fluorescentiemicroscopie
® kleuring v geïnfecteerde cellen met fluorescent gemerkt commercieel antilichaam
® virale antigenen aantonen met antigen-specifiek antilichaam -> direct of indirect
(3) elektronenmicroscopie
® opsporen v moeilijk te kweken virussen
® nooit eerder geïdentificeerde virussen aantonen obv morfologie v het virus
1.3.3 Aantonen van virale nucleïnezuren
- w specifieke primers/probes gebruikt
® zijn oligonucleotide sequenties complementair aan virale DNA of RNA sequentie
1.3.3.1 In situ hybridisatie-techniek voor detectie van DNA of RNA in weefsels
- vrdeel techniek: virus opgespoord + gelocaliseerd in het weefselstaal
- stappen:
(1) weefselcoupe fixeren
(2) behandeling met proteïnase
(3) hybridisatie met gemerkte probe
(4) detectie met enzym-gekoppelde antilichamen
(5) enzymreactie met substraat -> kleurreactie thv virus-positieve cellen
(6) microscopische evaluatie
3
, 1.3.3.2 PCR en RT-PCR
= genetisch materiaal v het virus amplificeren iav 2 specifieke primers
-> PCR = polymerase chain reaction gebruikt bij DNA virussen
-> RT = reverse transcriptase gebruikt bij RNA virussen
voordelen nadelen
superieure gevoeligheid contaminatie tssn stalen, labocontaminatie
superieure specificiteit mogelijke inhibitie dr PCR-inhiberende componenten in serum
korte responstijd relatief duur
- nested-PCR = 1e amplificeren met 1e primerset dan met 2e primerset die amplicon afbakent om
gevoeligheid te verhogen
- real-time PCR = kwantitatieve PCR = aantal kopijen precies bepalen
Basisprincipe v de PCR techniek
= RNA omzetten nr cDNA dmv reverse transcriptase enzym
- DNA staal onderworpen aan temp programmas
+ bu?er met MgCl2 1) initiële denaturatie DNA (2min 94°C)
+ 4 deoxynucleoside-trifosfaten (dATP, dCTP, dGTP en dTTP) 2) denaturatie DNA (40x 30s bij 94°C +
+ enzym (hittestabiel Taq DNA-polymerase) hybridisatie primer en doelwit DNA 45s
+ 2 primers (dienen vr DNA op te sporen) bij 60°C + DNA extensie primer 60s bij
92°C)
3) extensie onafgewerkte DNA stukken
(5min bij 72°C)
einde: veel kopijen v amplicon (afgebakend stukje dr primers)
- analyseren mbv gelelektroforese + ethiumbromide -> DNA bandjes onder UV licht waarnemen
® niet kwantitatief want detectie op eindpunt
ð enzymatische polymerisatiereactie heeft plateau bereikt
Principe v de real-time PCR techniek
= kwantitatieve PCR = aantal DNA kopijen bij aanvang exact berekenen
- PCR reactie in tijd volgen
® toename in fluorescent signaal ifv aantal PCR cycli uitgezet
ð veel DNA:
• exponentiële curve stijgt sneller
• minder amplificatiecycli (= cycle treshold)
- fluorescentie:
(1) DNA-intercalerende fluorescerende stof toevoegen
ð DNA geamplificeerd -> meer intercalator ingebouwd -> meer fluorescentie
(2) DNA probe gemerkt met reporter en quencher molecule = Taqman probe
ð probe + doelwit DNA -> geen signaal want quencher doogt reporter
ð polymerase enzym verdrijft probe v DNA en knipt het los -> quencher en reporter gescheiden ->
reporter geeft signaal
4
1.1 Morfologie en classificatie van virussen
- virussen:
® kleinst gekende infectieuze deeltjes
® obligate intracellulaire deeltjes
® niet autonoom vermenigvuldigen
® uitgesproken species-specifiteit
1.1.1 Microscopie van virussen en hun cytopathogeen e?ect
- diameter v virussen = minder dan 1 µm knn met elektronenmicroscoop bekeken w
® kleinste virussen: ong 30 nm en de invloeden v virussen op cel knn wél licht-
® grootste humane virus: 400 nm microscopisch bekeken w
- cytopathogeen e?ect/CPE
= vernietiging v gastheercellen of wijziging in celmorfologie tgv virusreplicatie
ð men kan hiervr beroep doen op celculturen
1.1.2 Opbouw van viruspartikels
- viruspartikels/virions bevatten genetisch materiaal omgeven dr eiwitmantel/capside = nucleocapside
® bij sommige virussen enveloppe = lipide buitenlaag rond capside
® andere virussen geen enveloppe = naakt virus
- viraal genoom = bestaat uit RNA of DNA, ss of ds
® sommigen zeer compact genoom met overlappende genen
® anderen gebruiken alternatieve splicing mechanismen vr max verscheidenheid aan eiwitten
- capside = viraal-gecodeerde proteïnestructuur die bestaat uit repetitieve eenheden/capsomeren
® structuur: eicosahedraal of helicaal
ð complexe virussen geen v beiden
- enveloppe
(a) fosfolipide-dubbellaag
ð afkomstig v celmembraan
• w verworven wnr virussen op einde v replicatie de cel verlaten dr budding
(b) glycoproteïne uitsteeksels/peplomeren/spikes
ð viraal gecodeerd
ð structureel + immunologisch belang -> fungeren als antigen wrtegen gastheer immuniteit ontwikkelt
1.2 Virustransmissie en pathogenese
1.2.1 Transmissieroutes
- feco-oraal bv dr slechte handhygiëne
- respiratoir
- rechtstreeks contact met besmette huid, speeksel, urine, voorwerp
- seksueel
- parenteraal via besmet bloed
- verticaal (= v moeder op kind) -> prenataal (dr placenta), perinataal (geboortekanaal) of postnataal (melk)
- via besmette dieren
1
,- route w mee bepaald dr stabiliteit v het virus buiten de gastheer
® niet geënvelopeerde virussen overleven makkelijker in buitenwereld
® geënvelopeerde virussen zeer gevoelig vr uitdroging, extreme temp of extreme pH
1.2.2 Virussen overgedragen door dieren
- zoönose = infectie nr de mens overgedragen dr een gewervelde diersoort al of niet met tssnkomst v insect
- arbovirus = virus overgedragen dr arthropoden (geleedpotigen zoals insecten en teken)
1.2.3 E?iciëntie van verspreiding
- besmettelijkheid = hoe succesvol de transmissie v het virus is
® afh v versch factoren
- basisreproductiegetal R0 = hoeveel personen gem sec besmet w dr 1 prim besmette persoon in situatie wrin
populatie geen immuniteit heeft en geen maatregelen zijn getro?en om
verspreiding in te perken
1.2.4 Incubatietijd
= tijd tssn blootstelling aan het virus en de ziektesymptomen
1.2.5 Ziektebeloop in de tijd
acute infectie lysis v de geïnfecteerde cellen
-> vb rhinovirus
latente infectie virus na 1e contact verborgen in lichaam zonder replicatie, mr kan
reactiveren bij verminderde immuniteit
-> vb herpex simplex virus
chronisch persistente infectie langdurige lage-graad virusreplicatie wrbij drager continu
besmettelijk is
-> vb HIV
asymptomatische/subklinische infectie
oncogene virussen gastheercellen transformeren tot continu delende cellen en dit
leidt tot kwaadaardige tumoren
-> vb papillomavirussen
1.2.6 Immuniteit van de gastheercel
- sommige virussen genereren levenslange immuniteit bij gastheer wrdr infectie 1 malig is
® met e?iciënt vaccin een langdurige tot levenslange bescherming
- andere virussen kan elk individu meerdere keren geïnfecteerd geraken
® virus komt vr in versch serotypes of ondergaat voortdurend genetische wijziging
- meest succesvolle virussen zijn chronisch-persistent aanwezigen wegens goede wereldwijde verspreiding
® immune-evasion mechanismen
ð overleven in gastheer gegarandeerd drdat natuurlijke of adaptieve immuunrespons w omzeild
1.3 Laboratoriumdiagnostiek bij virusinfecties
- aantonen virusinfectie dr:
(1) opsporing v virus
(2) opsporing v virus-specifieke antisto?en
2
,- voordelen serologische strategieën:
® sneller, geen kweek v specimen
® antisto?en knn aangetoond w nadat het virus verdwenen is
- actuele infectie aantonen: stijging v de IgG antistoftiter dr serumpaar aantonen
® 1 serumstaal volstaat alleen bij bepaling v virus-specifieke IgM antisto?en
ð IgM vroeger na blootstelling aanwezig dan IgG
- seroconversie = geïnfecteerde persoon evolueert v seronegatief nr seropositief
- convalescentie periode = herstelperiode na acute fase
® antistoftiter eerst hoog, drna geleidelijk dalen
Diagnostische test beoordelen
- gevoeligheid - snelheid/responstijd
- specificiteit - kostprijs
1.3.1 Virusisolatie en -kweek
- gebeurt vr microscopie
in vitro celcultuur
in ovo bebroede kippeneieren
in vivo pasgeboren muizen
1.3.2 Microscopische technieken
(1) lichtmicroscopie
® obv virus-karakteristieke cytopathogeen e?ect (CPE)
(2) fluorescentiemicroscopie
® kleuring v geïnfecteerde cellen met fluorescent gemerkt commercieel antilichaam
® virale antigenen aantonen met antigen-specifiek antilichaam -> direct of indirect
(3) elektronenmicroscopie
® opsporen v moeilijk te kweken virussen
® nooit eerder geïdentificeerde virussen aantonen obv morfologie v het virus
1.3.3 Aantonen van virale nucleïnezuren
- w specifieke primers/probes gebruikt
® zijn oligonucleotide sequenties complementair aan virale DNA of RNA sequentie
1.3.3.1 In situ hybridisatie-techniek voor detectie van DNA of RNA in weefsels
- vrdeel techniek: virus opgespoord + gelocaliseerd in het weefselstaal
- stappen:
(1) weefselcoupe fixeren
(2) behandeling met proteïnase
(3) hybridisatie met gemerkte probe
(4) detectie met enzym-gekoppelde antilichamen
(5) enzymreactie met substraat -> kleurreactie thv virus-positieve cellen
(6) microscopische evaluatie
3
, 1.3.3.2 PCR en RT-PCR
= genetisch materiaal v het virus amplificeren iav 2 specifieke primers
-> PCR = polymerase chain reaction gebruikt bij DNA virussen
-> RT = reverse transcriptase gebruikt bij RNA virussen
voordelen nadelen
superieure gevoeligheid contaminatie tssn stalen, labocontaminatie
superieure specificiteit mogelijke inhibitie dr PCR-inhiberende componenten in serum
korte responstijd relatief duur
- nested-PCR = 1e amplificeren met 1e primerset dan met 2e primerset die amplicon afbakent om
gevoeligheid te verhogen
- real-time PCR = kwantitatieve PCR = aantal kopijen precies bepalen
Basisprincipe v de PCR techniek
= RNA omzetten nr cDNA dmv reverse transcriptase enzym
- DNA staal onderworpen aan temp programmas
+ bu?er met MgCl2 1) initiële denaturatie DNA (2min 94°C)
+ 4 deoxynucleoside-trifosfaten (dATP, dCTP, dGTP en dTTP) 2) denaturatie DNA (40x 30s bij 94°C +
+ enzym (hittestabiel Taq DNA-polymerase) hybridisatie primer en doelwit DNA 45s
+ 2 primers (dienen vr DNA op te sporen) bij 60°C + DNA extensie primer 60s bij
92°C)
3) extensie onafgewerkte DNA stukken
(5min bij 72°C)
einde: veel kopijen v amplicon (afgebakend stukje dr primers)
- analyseren mbv gelelektroforese + ethiumbromide -> DNA bandjes onder UV licht waarnemen
® niet kwantitatief want detectie op eindpunt
ð enzymatische polymerisatiereactie heeft plateau bereikt
Principe v de real-time PCR techniek
= kwantitatieve PCR = aantal DNA kopijen bij aanvang exact berekenen
- PCR reactie in tijd volgen
® toename in fluorescent signaal ifv aantal PCR cycli uitgezet
ð veel DNA:
• exponentiële curve stijgt sneller
• minder amplificatiecycli (= cycle treshold)
- fluorescentie:
(1) DNA-intercalerende fluorescerende stof toevoegen
ð DNA geamplificeerd -> meer intercalator ingebouwd -> meer fluorescentie
(2) DNA probe gemerkt met reporter en quencher molecule = Taqman probe
ð probe + doelwit DNA -> geen signaal want quencher doogt reporter
ð polymerase enzym verdrijft probe v DNA en knipt het los -> quencher en reporter gescheiden ->
reporter geeft signaal
4
