Hoofdstuk 5: Microscopie
5.1 Fluorescentiemicroscopie
= gebaseerd op de absorptie van licht bij een bepaalde golflengte & emissie van licht met een langere
golflengte
- Specifieke moleculen visualiseren door autofluorescentie of door specifieke fluoroforen of
fluorescente proteines te koppelen aan deze moleculen (Alexa, Green Fluorescent Protein)
Fluorescente moleculen licht met bepaalde golflengte
absorberen => van grond- naar aangeslagen toestand =>
klein deel van energie verliezen & terugvallen nr
grondtoestand waarbij er licht wordt uitgestuurd
Niet elk licht kan dit fluorescent moleculen gaan exciteren => moet bepaalde golflengte hebben
- Excitatiespectrum = hoogte curve komt overeen met licht
die met die specifieke golflengte fluorescente moleculen
gaat exciteren
- Emissiespectrum = hoogte curve komt overeen met
waarschijnlijkheid dat licht met bepaalde golflengte wordt
uitgestuurd
We kunnen spelen met 2 bundels:
- Specifieke golflengte gebruiken zodanig dat we bepaald moleculen gaan exciteren, andere
moleculen niet => specifiek signaal
- Verschillende golflengtes gebruiken zodat we verschillende moleculen gaan exciteren =>
daarna gaan filteren => zo bepaalde golflengte eruit halen
Intenser laserlicht => beter signaal, maar rekening houden met effecten:
- Bleaching: na herhaaldelijke blootstelling aan excitatielicht => fluorescente moleculen gaan
fluorescente eigenschap verliezen
5.1.1 Epi-fluorescentie
Verschil met lichtmicroscopie = hier hebben we 2 bundels
- Excitatielicht waarmee we de fluorescente moleculen gaan exciteren
- Emissielicht
Componenten:
- Excitatiefilter
- Emissiefilter
- Kleur selectieve filter
- Gecombineerd in 1 onderdeel = filter cube
- Onderdelen optimaal op elkaar afstellen zo
1
,Werking:
- Lichtbron (polychromatisch = verschillende golflengtes => grotere flexibiliteit)
- Specifieke golflengte selecteren door excitatiefilter bv. enkel blauwe licht doorlaten
- Stel monochromatisch (bv. laser): geen filter meer nodig, maar flexibiliteit eerder
beperkt
- Blauwe licht gaat invallen op kleur selectieve spiegel = spiegel die enkel licht met bepaalde
golflengte gaat weerspiegelen & andere doorlaten => dit blauwe licht weerspiegelen
- Op specimen terecht komen => fluorescente moleculen exciteren
- Fluorescent signaal uitsturen met langere golflengte & lagere energie
- Terug door kleur selectieve spiegel => nu niet gespiegeld, maar doorgelaten
- Door emissiefilter om kleur tegen te houden of strooilicht tegen te houden
Voordeel:
- Zorgt voor goed contrast
Nadeel:
- Zorgen dat er fluorescente moleculen aanwezig zijn die specifieke informatie bevat
- Microscoop scherp gesteld op focale vlak => enkel contrast in focale vlak zodanig dat
specimen goed in beeld is MAAR volledige specimen hier overspoelen met excitatielicht =>
dus overal waar blauw licht geraakt, gaan moleculen worden geëxciteerd (boven en onder
het focale vlak)
- Achtergrondfluorescentie
- Beperkte scherptediepte
- Zeer beperkte 3D-informatie
<> Optical Sectioning:
- Relatief eenvoudig monstervoorbereiding
- Geen schade aan het monster => meerdere tijdspunten (dynamische processen of beweging)
<> Coupes maken
- Technisch moeilijker uit te voeren en tijdsrovend
- Hoogste resolutie en sensitiviteit
5.1.2 Confocale microscopie
2 pinholes in het focale vlak:
- Pinhole voor lichtbron: ervoor zorgen dat we zeer klein deel van specimen gaan belichten,
focussen op specifiek punt op specimen
- Pinhole voor detector: enkel maar een klein deel van het specimen in beeld gaan brengen
- Stel dat fluorescent licht zich boven of onder het focale vlak bevinden => fluorescent licht
doorheen de pinhole wordt tegengehouden
Nadeel:
- Punt voor punt staal opmeten = tijdsrovend
Voordeel:
2
, - Zorgt wel voor betere resolutie/scherper beeld door secundaire fluorescentie buiten dit punt
in het focale vlak te verwijderen => betere optische doorsnede
Laser Scanning Confocale Microscopie (LSCM)
- Laser
- AOTF = kan pinhole zijn, kan ook lenzensysteem zijn
- 2 spiegels die kunnen bewegen => zo wordt excitatielicht altijd op
andere plaats van het staal geprojecteerd
- Door invalshoek van bundel op onze objectief lens te laten variëren
=> ander punt van specimen belichten
- Zo in 2D onze belichtingsbundel over staal gaan
- Eenmaal focale vlak is gescand => optische doorsnede
- Opnieuw een andere optische doorsnede in beeld brengen => hoogte van staal
veranderen dus focale vlak komt nu overeen met andere optische doorsnede
=> doorsnedes samenvoegen & zo 2D vormen
Gebruik van een PMT detector:
= detector waarbij fotonen worden omgezet naar e- via kathode en anode
- Aan kathode gaan fotonen invallen
- Gaan beperkt aantal e- losslaan door energie die ze afgeven
- e- aangetrokken door dynodes
- Botsing met dynodes
- Zo meer en meer e- losslaan
- Op het einde zeer sterk signaal meten
Voordeel:
- Ideale techniek voor optische doorsnede
Nadeel:
- geen efficiënt gebruik van licht (minder gevoelig dan epi)
- Raster techniek => tijdrovend
- hoog energetisch laserlicht en lange exposure tijden
=> kans op lichtbeschadiging en bleaching
=> niet geschikt voor levende cellen
- slechts enkele excitatie golflengtes owv gebruik van lasers - hoge kost toestel + beperkte
levensduur laser
Spinning Disk Confocale Microscopie
= roterende schijf met verschillende pinholes om tegelijkertijd verschillende punten van het
specimen in beeld te brengen
Principe:
- gebasseerd op nipkow disk => sequentie van 1D signalen
- Excitatielicht verspreiden over pinholes => langs bepaalde lijn doorheen specimen sturen =>
via lenzen op specimen
- Fluorescent licht volgt hetzelfde pad als excitatielicht & gaat opnieuw door pinhole => zo
signaal beperken tot focale vlak => verder geleidt naar de detector
- Verbeterde transmissie van excitatielicht door tweede schijf met microlenzen
3
, Eigenschappen (helderheid, contrast en kwaliteit) van optische doorsnede bepaald door configuratie
pinholes:
- ong 4% licht doorgelaten (laser nodig) bij standaard configuratie ( D = 25-50 μm <> S = 250
μm)
- Meer pinholes dichter bij elkaar => meer licht transmissie
<> out of focus licht door naburige pinholes (meer bij dikkere specimens)
Nadeel:
- Pinholes dichter plaatsen => sensitiever werken => meer risico op autofocus door de
naburige pinholes
- Op focale vlak werken, boven en onder wordt tegengehouden
- Verder van focale vlak => openingshoek veel ruimer => licht kan ontsnappen door naburige
pinholes
- Dus als pinholes dichter bij elkaar staan => sneller lekkage van F licht boven en onder focale
vlak
- Korte sluitingstijd & laat toerental => strepen artefacten, sluitingstijd veel te kort dat deel van
specimen niet wordt opgemeten
- Grote sluitingstijd & dezelfde toerental => streep artefacten verdwijnen
- Grote sluitingstijd & hoog toerental => spinning disk sneller draaien dus ook meer opnames
maken => artefacten ook verdwijnen
Voordeel:
- Bij spinning disk: achtergrondF, iets minder qua kwaliteit laser scanning, maar wel betere
kwaliteit tov breedveld; bij breedveld toch veel achtergrondlicht; bij confocale krijg je zeer
sterk optische doorsnede
- Relatieve sensiteit
o Efficiënter gebruik van licht
o zachtere en snellere techniek (minder toxiciteit en bleaching) <> LSCM
o levende cellen en dynamische processen over langere tijdsintervallen
<> Mindere resolutie (minder goede optische doorsnede) tov LSCM
4
5.1 Fluorescentiemicroscopie
= gebaseerd op de absorptie van licht bij een bepaalde golflengte & emissie van licht met een langere
golflengte
- Specifieke moleculen visualiseren door autofluorescentie of door specifieke fluoroforen of
fluorescente proteines te koppelen aan deze moleculen (Alexa, Green Fluorescent Protein)
Fluorescente moleculen licht met bepaalde golflengte
absorberen => van grond- naar aangeslagen toestand =>
klein deel van energie verliezen & terugvallen nr
grondtoestand waarbij er licht wordt uitgestuurd
Niet elk licht kan dit fluorescent moleculen gaan exciteren => moet bepaalde golflengte hebben
- Excitatiespectrum = hoogte curve komt overeen met licht
die met die specifieke golflengte fluorescente moleculen
gaat exciteren
- Emissiespectrum = hoogte curve komt overeen met
waarschijnlijkheid dat licht met bepaalde golflengte wordt
uitgestuurd
We kunnen spelen met 2 bundels:
- Specifieke golflengte gebruiken zodanig dat we bepaald moleculen gaan exciteren, andere
moleculen niet => specifiek signaal
- Verschillende golflengtes gebruiken zodat we verschillende moleculen gaan exciteren =>
daarna gaan filteren => zo bepaalde golflengte eruit halen
Intenser laserlicht => beter signaal, maar rekening houden met effecten:
- Bleaching: na herhaaldelijke blootstelling aan excitatielicht => fluorescente moleculen gaan
fluorescente eigenschap verliezen
5.1.1 Epi-fluorescentie
Verschil met lichtmicroscopie = hier hebben we 2 bundels
- Excitatielicht waarmee we de fluorescente moleculen gaan exciteren
- Emissielicht
Componenten:
- Excitatiefilter
- Emissiefilter
- Kleur selectieve filter
- Gecombineerd in 1 onderdeel = filter cube
- Onderdelen optimaal op elkaar afstellen zo
1
,Werking:
- Lichtbron (polychromatisch = verschillende golflengtes => grotere flexibiliteit)
- Specifieke golflengte selecteren door excitatiefilter bv. enkel blauwe licht doorlaten
- Stel monochromatisch (bv. laser): geen filter meer nodig, maar flexibiliteit eerder
beperkt
- Blauwe licht gaat invallen op kleur selectieve spiegel = spiegel die enkel licht met bepaalde
golflengte gaat weerspiegelen & andere doorlaten => dit blauwe licht weerspiegelen
- Op specimen terecht komen => fluorescente moleculen exciteren
- Fluorescent signaal uitsturen met langere golflengte & lagere energie
- Terug door kleur selectieve spiegel => nu niet gespiegeld, maar doorgelaten
- Door emissiefilter om kleur tegen te houden of strooilicht tegen te houden
Voordeel:
- Zorgt voor goed contrast
Nadeel:
- Zorgen dat er fluorescente moleculen aanwezig zijn die specifieke informatie bevat
- Microscoop scherp gesteld op focale vlak => enkel contrast in focale vlak zodanig dat
specimen goed in beeld is MAAR volledige specimen hier overspoelen met excitatielicht =>
dus overal waar blauw licht geraakt, gaan moleculen worden geëxciteerd (boven en onder
het focale vlak)
- Achtergrondfluorescentie
- Beperkte scherptediepte
- Zeer beperkte 3D-informatie
<> Optical Sectioning:
- Relatief eenvoudig monstervoorbereiding
- Geen schade aan het monster => meerdere tijdspunten (dynamische processen of beweging)
<> Coupes maken
- Technisch moeilijker uit te voeren en tijdsrovend
- Hoogste resolutie en sensitiviteit
5.1.2 Confocale microscopie
2 pinholes in het focale vlak:
- Pinhole voor lichtbron: ervoor zorgen dat we zeer klein deel van specimen gaan belichten,
focussen op specifiek punt op specimen
- Pinhole voor detector: enkel maar een klein deel van het specimen in beeld gaan brengen
- Stel dat fluorescent licht zich boven of onder het focale vlak bevinden => fluorescent licht
doorheen de pinhole wordt tegengehouden
Nadeel:
- Punt voor punt staal opmeten = tijdsrovend
Voordeel:
2
, - Zorgt wel voor betere resolutie/scherper beeld door secundaire fluorescentie buiten dit punt
in het focale vlak te verwijderen => betere optische doorsnede
Laser Scanning Confocale Microscopie (LSCM)
- Laser
- AOTF = kan pinhole zijn, kan ook lenzensysteem zijn
- 2 spiegels die kunnen bewegen => zo wordt excitatielicht altijd op
andere plaats van het staal geprojecteerd
- Door invalshoek van bundel op onze objectief lens te laten variëren
=> ander punt van specimen belichten
- Zo in 2D onze belichtingsbundel over staal gaan
- Eenmaal focale vlak is gescand => optische doorsnede
- Opnieuw een andere optische doorsnede in beeld brengen => hoogte van staal
veranderen dus focale vlak komt nu overeen met andere optische doorsnede
=> doorsnedes samenvoegen & zo 2D vormen
Gebruik van een PMT detector:
= detector waarbij fotonen worden omgezet naar e- via kathode en anode
- Aan kathode gaan fotonen invallen
- Gaan beperkt aantal e- losslaan door energie die ze afgeven
- e- aangetrokken door dynodes
- Botsing met dynodes
- Zo meer en meer e- losslaan
- Op het einde zeer sterk signaal meten
Voordeel:
- Ideale techniek voor optische doorsnede
Nadeel:
- geen efficiënt gebruik van licht (minder gevoelig dan epi)
- Raster techniek => tijdrovend
- hoog energetisch laserlicht en lange exposure tijden
=> kans op lichtbeschadiging en bleaching
=> niet geschikt voor levende cellen
- slechts enkele excitatie golflengtes owv gebruik van lasers - hoge kost toestel + beperkte
levensduur laser
Spinning Disk Confocale Microscopie
= roterende schijf met verschillende pinholes om tegelijkertijd verschillende punten van het
specimen in beeld te brengen
Principe:
- gebasseerd op nipkow disk => sequentie van 1D signalen
- Excitatielicht verspreiden over pinholes => langs bepaalde lijn doorheen specimen sturen =>
via lenzen op specimen
- Fluorescent licht volgt hetzelfde pad als excitatielicht & gaat opnieuw door pinhole => zo
signaal beperken tot focale vlak => verder geleidt naar de detector
- Verbeterde transmissie van excitatielicht door tweede schijf met microlenzen
3
, Eigenschappen (helderheid, contrast en kwaliteit) van optische doorsnede bepaald door configuratie
pinholes:
- ong 4% licht doorgelaten (laser nodig) bij standaard configuratie ( D = 25-50 μm <> S = 250
μm)
- Meer pinholes dichter bij elkaar => meer licht transmissie
<> out of focus licht door naburige pinholes (meer bij dikkere specimens)
Nadeel:
- Pinholes dichter plaatsen => sensitiever werken => meer risico op autofocus door de
naburige pinholes
- Op focale vlak werken, boven en onder wordt tegengehouden
- Verder van focale vlak => openingshoek veel ruimer => licht kan ontsnappen door naburige
pinholes
- Dus als pinholes dichter bij elkaar staan => sneller lekkage van F licht boven en onder focale
vlak
- Korte sluitingstijd & laat toerental => strepen artefacten, sluitingstijd veel te kort dat deel van
specimen niet wordt opgemeten
- Grote sluitingstijd & dezelfde toerental => streep artefacten verdwijnen
- Grote sluitingstijd & hoog toerental => spinning disk sneller draaien dus ook meer opnames
maken => artefacten ook verdwijnen
Voordeel:
- Bij spinning disk: achtergrondF, iets minder qua kwaliteit laser scanning, maar wel betere
kwaliteit tov breedveld; bij breedveld toch veel achtergrondlicht; bij confocale krijg je zeer
sterk optische doorsnede
- Relatieve sensiteit
o Efficiënter gebruik van licht
o zachtere en snellere techniek (minder toxiciteit en bleaching) <> LSCM
o levende cellen en dynamische processen over langere tijdsintervallen
<> Mindere resolutie (minder goede optische doorsnede) tov LSCM
4
