Neurobiologie – samenvatting deel 1
Hoofdstuk 1: introduction and techniques
Zenuwcellen
-discrete cellen -> communicatie via speciale verbindingen, synapsen en gap junctions
-presynaps laat neurotransmitters uit synaptische blaasjes (vesicles) los in synaptische spleet tot
postsynaps -> communicatie via elektrische signalen
-via dendrieten, soma en axon
-dendrieten en soma hebben overal synapsen om zich heen (niet enkel aan uiteinden)
-veel bestudeert in: fruitvlieg/muis/zebravis/nematode -> makkelijke genetische analyse/manipulatie
Breincellen
-twee typen cellen:
-neuronen:
-geven snel elektrische signalen over lange afstanden door via actiepotentialen via
één lang axon (output) en meer dendrieten (input)
-kort axon bij interneuronen
-signaalsterkte moet gelijk blijven in axonen
-informatie komt via veel andere cellen binnen, hier moet wat mee worden gedaan
-veel verschillen in morfologie
-cerebellaire cellen meeste connecties in brein -> beweging finetunen
-connectiviteit -> groot aantal is zeer gespecialiseerd:
-divergent is er veel output
-convergent is er veel input
-neuropil is alles tussen cellichamen waar synaptische verbindingen worden gevormd
tussen dendrieten, axonen en gliacellen
-afferent = informatie naar hersenen en ruggengraat toe
-efferente = informatie van hersenen en ruggengraat af
-veel mitochondria bij synapsen, geen ER in axonen en dendrieten
-gliacellen:
-structureel en metabolisch support
-verwijderen neurotransmitters en zorgen voor goed milieu en helpen dus bij
transmissie synapsen
-ondersteunen neuronale ontwikkeling
-versnellen propagatie van neuronale impulsen (Schwanncellen en CNS)
-drie typen gliacellen:
-astrocyten CZS: onderhouden lokaal chemische omgeving voor neuronaal
signaleren -> vorming BBB, loslaten stoffen voor vormen nieuwe synaptische
verbindingen en stamcel functie in subventriculaire zone
-oligodendrocyten CZS: myelinescheden voor transmissiesnelheid, samen met
Schwann cellen in perifiere zenuwstelsel. Ook deels stamcelfunctie in witte
stof
, -microgliale cellen: van hematopoietische precursor cellen, soort macrofagen
-> ruimen op en secreren signaalmoleculen (cytokines) bij schade
Kniepeesreflex (myotatic reflex)
-sensorisch neuron is divergent -> meerdere outputs en één input
Technieken connectiviteit: visualisatie van zenuwcellen
-kleuring (staining): antilichamen en Nissle (nucleus)
-kleurstof (dye): anterograde (injectie in somata, diffusie naar zenuwuiteinden) & retrograde (injectie
in axon terminals, diffusie naar cellichamen)
-onderzoek voorbeeld: tracers gebruiken om te kijken of opnieuw neuron connecties worden
gevormd bij spierschade. Voor schade tracer toevoegen, dan een tijd na de schade andere
tracer toevoegen. Op plekken waar kleuren vermengen ontstaan nieuwe neurons.
-reporter genen: GFP, RFP, CFP expressie -> kan lokaal via specifieke promotor
-calcium imaging, elektrofysiologie en brain imaging
-kan op live en enkele cellen
-single-unit elektrofysiologische opnamen maken -> stimulus patronen ontdekken (kniepeesreflex)
-intracellulair meet beter synaptisch potentiaal dan extracellulaire meting
-niet meerdere cellen tegelijk!
-voor morfologie neuron: golgi staining en dye injectie (GFP)
Transgene muizen maken makkelijker -> GFP expressie in bepaalde cellen
-promotor gebruiken die enkel aanwezig is in bepaald celtype, deze promotor klonen voor GFP gen,
GFP zal daardoor enkel tot expressie komen in dit specifieke celtype -> vaak met cDNA
-hierbij dus gen ergens in genoom, geen controle waar je dit doet, bij knock-out/in doe je dit wel
specifiek
-knock-in/out worden beide allelen van een gen verwijdert/vervangen via homologe
recombinatie, beide vormen een ‘ziektemodel’
-waar zit neurotransmitter in brein -> fuseer neurotransmitter met GFP
,-voeg sequentie GFP toe via homologe recombinatie, selecteer cellen en transplanteer deze in dieren
-daarvoor: gen toevoegen aan stamcellen blastocyst, deze injecteren in zwangere muis, hierbij door
laten fokken waarbij F2 ontstaat die homogene carrier is
Stappenplan knock-out muis (uitgebreid)
1. Isoleer embryonale stamcellen (ECs) van muizen met bruine vacht
2. Kloneer twee homologie arms rondom exon 2 van een specifiek gen
3. Kloneer die homologie arms en vervang exon-2 met een selectie marker/resistentie aan
neomycine
4. Electroporate de plasmide (vector) met de homologie arms in de ES cellen
5. Induceer een dubbelstreng breuk met CRISPR-Cas9 en selecteer cellen die succesvolle
homologe recombinatie hebben ondergaan
6. Controleer deze cellen met PCR
7. Injecteer de correcte ES cellen terug in de blastula stage van een witte muis
8. Selecteer nakomelingen met chimeric vacht
9. Kruis de chimeric nakomelingen terug met een witte muis
10. Selecteer lichtbruine vacht (heterozygoot) nakomelingen en check voor deletie van gen met
PCR
11. Kruis twee heterozygoten muizen om een homozygote knock-out te krijgen
Via CRISPR-Cas nog makkelijker, knipt genoom op specifieke plekken
-breekt dubbelstrengs en wordt gerepareerd door DNA repair
-incorporeren van bepaalde sequentie via homologe recombinatie
, Conditionele knock-out/in maken
-conditioneel is een systeem waarbij exogene recombinase een unieke DNA sequentie herkent en aan
5’ en 3’ uiteinde een endogeen gen geëlimineerd wordt.
-Cre-Lox-P systeem -> bekijken wat een bepaald gen doet via knock-out
-enzym wordt dan enkel op specifieke plek verwijderd door specifieke promotor
-kan in ontwikkelingsstadia waarbij promotor pas later actief wordt
-kan ook tamoxifen (chemisch) geïnduceerd worden -> via genetisch gemodificeerde
oestrogeen receptor die niet aan endogeen oestrogeen kan binden (Cre:ERT)
-genfunctie en activatie Cre recombinase bij toedienen
1. Cre recombinase recombinatie in genoom tijdens mitotische DNA replicatie op locus
2. Expressie Cre recombinase via specifieke promotor van gen waarin is gezet
3. Cre recombinase actief op loxP bindingsplekken en zorgt voor eliminatie exon
GFP kan ook worden gebonden aan calmoduline -> calcium imaging
-fluorescentie wanneer calcium wordt gebonden door conformatieverandering
-genetisch gecodeerde calcium sensoren in zenuwcellen -> GFP aan calciumsensitief eiwit
-bij actiepotentialen en invloei calcium -> fluorescentie bij neuronale activiteit
-raam maken in schedel met coverslip en kleurstof
Induceren hersenactiviteit (en gedrag) via kanaal rodopsine
-komen van algen om licht waar te nemen
-induceren in muizen -> door stimulatie met licht openen/sluiten kanalen en cellen krijgen
actiepotentialen, kanaal rodopsine activeert (Ca/Na/H/K instroom) – halorodopsine deactiveert (Cl
instroom)
Hoofdstuk 1: introduction and techniques
Zenuwcellen
-discrete cellen -> communicatie via speciale verbindingen, synapsen en gap junctions
-presynaps laat neurotransmitters uit synaptische blaasjes (vesicles) los in synaptische spleet tot
postsynaps -> communicatie via elektrische signalen
-via dendrieten, soma en axon
-dendrieten en soma hebben overal synapsen om zich heen (niet enkel aan uiteinden)
-veel bestudeert in: fruitvlieg/muis/zebravis/nematode -> makkelijke genetische analyse/manipulatie
Breincellen
-twee typen cellen:
-neuronen:
-geven snel elektrische signalen over lange afstanden door via actiepotentialen via
één lang axon (output) en meer dendrieten (input)
-kort axon bij interneuronen
-signaalsterkte moet gelijk blijven in axonen
-informatie komt via veel andere cellen binnen, hier moet wat mee worden gedaan
-veel verschillen in morfologie
-cerebellaire cellen meeste connecties in brein -> beweging finetunen
-connectiviteit -> groot aantal is zeer gespecialiseerd:
-divergent is er veel output
-convergent is er veel input
-neuropil is alles tussen cellichamen waar synaptische verbindingen worden gevormd
tussen dendrieten, axonen en gliacellen
-afferent = informatie naar hersenen en ruggengraat toe
-efferente = informatie van hersenen en ruggengraat af
-veel mitochondria bij synapsen, geen ER in axonen en dendrieten
-gliacellen:
-structureel en metabolisch support
-verwijderen neurotransmitters en zorgen voor goed milieu en helpen dus bij
transmissie synapsen
-ondersteunen neuronale ontwikkeling
-versnellen propagatie van neuronale impulsen (Schwanncellen en CNS)
-drie typen gliacellen:
-astrocyten CZS: onderhouden lokaal chemische omgeving voor neuronaal
signaleren -> vorming BBB, loslaten stoffen voor vormen nieuwe synaptische
verbindingen en stamcel functie in subventriculaire zone
-oligodendrocyten CZS: myelinescheden voor transmissiesnelheid, samen met
Schwann cellen in perifiere zenuwstelsel. Ook deels stamcelfunctie in witte
stof
, -microgliale cellen: van hematopoietische precursor cellen, soort macrofagen
-> ruimen op en secreren signaalmoleculen (cytokines) bij schade
Kniepeesreflex (myotatic reflex)
-sensorisch neuron is divergent -> meerdere outputs en één input
Technieken connectiviteit: visualisatie van zenuwcellen
-kleuring (staining): antilichamen en Nissle (nucleus)
-kleurstof (dye): anterograde (injectie in somata, diffusie naar zenuwuiteinden) & retrograde (injectie
in axon terminals, diffusie naar cellichamen)
-onderzoek voorbeeld: tracers gebruiken om te kijken of opnieuw neuron connecties worden
gevormd bij spierschade. Voor schade tracer toevoegen, dan een tijd na de schade andere
tracer toevoegen. Op plekken waar kleuren vermengen ontstaan nieuwe neurons.
-reporter genen: GFP, RFP, CFP expressie -> kan lokaal via specifieke promotor
-calcium imaging, elektrofysiologie en brain imaging
-kan op live en enkele cellen
-single-unit elektrofysiologische opnamen maken -> stimulus patronen ontdekken (kniepeesreflex)
-intracellulair meet beter synaptisch potentiaal dan extracellulaire meting
-niet meerdere cellen tegelijk!
-voor morfologie neuron: golgi staining en dye injectie (GFP)
Transgene muizen maken makkelijker -> GFP expressie in bepaalde cellen
-promotor gebruiken die enkel aanwezig is in bepaald celtype, deze promotor klonen voor GFP gen,
GFP zal daardoor enkel tot expressie komen in dit specifieke celtype -> vaak met cDNA
-hierbij dus gen ergens in genoom, geen controle waar je dit doet, bij knock-out/in doe je dit wel
specifiek
-knock-in/out worden beide allelen van een gen verwijdert/vervangen via homologe
recombinatie, beide vormen een ‘ziektemodel’
-waar zit neurotransmitter in brein -> fuseer neurotransmitter met GFP
,-voeg sequentie GFP toe via homologe recombinatie, selecteer cellen en transplanteer deze in dieren
-daarvoor: gen toevoegen aan stamcellen blastocyst, deze injecteren in zwangere muis, hierbij door
laten fokken waarbij F2 ontstaat die homogene carrier is
Stappenplan knock-out muis (uitgebreid)
1. Isoleer embryonale stamcellen (ECs) van muizen met bruine vacht
2. Kloneer twee homologie arms rondom exon 2 van een specifiek gen
3. Kloneer die homologie arms en vervang exon-2 met een selectie marker/resistentie aan
neomycine
4. Electroporate de plasmide (vector) met de homologie arms in de ES cellen
5. Induceer een dubbelstreng breuk met CRISPR-Cas9 en selecteer cellen die succesvolle
homologe recombinatie hebben ondergaan
6. Controleer deze cellen met PCR
7. Injecteer de correcte ES cellen terug in de blastula stage van een witte muis
8. Selecteer nakomelingen met chimeric vacht
9. Kruis de chimeric nakomelingen terug met een witte muis
10. Selecteer lichtbruine vacht (heterozygoot) nakomelingen en check voor deletie van gen met
PCR
11. Kruis twee heterozygoten muizen om een homozygote knock-out te krijgen
Via CRISPR-Cas nog makkelijker, knipt genoom op specifieke plekken
-breekt dubbelstrengs en wordt gerepareerd door DNA repair
-incorporeren van bepaalde sequentie via homologe recombinatie
, Conditionele knock-out/in maken
-conditioneel is een systeem waarbij exogene recombinase een unieke DNA sequentie herkent en aan
5’ en 3’ uiteinde een endogeen gen geëlimineerd wordt.
-Cre-Lox-P systeem -> bekijken wat een bepaald gen doet via knock-out
-enzym wordt dan enkel op specifieke plek verwijderd door specifieke promotor
-kan in ontwikkelingsstadia waarbij promotor pas later actief wordt
-kan ook tamoxifen (chemisch) geïnduceerd worden -> via genetisch gemodificeerde
oestrogeen receptor die niet aan endogeen oestrogeen kan binden (Cre:ERT)
-genfunctie en activatie Cre recombinase bij toedienen
1. Cre recombinase recombinatie in genoom tijdens mitotische DNA replicatie op locus
2. Expressie Cre recombinase via specifieke promotor van gen waarin is gezet
3. Cre recombinase actief op loxP bindingsplekken en zorgt voor eliminatie exon
GFP kan ook worden gebonden aan calmoduline -> calcium imaging
-fluorescentie wanneer calcium wordt gebonden door conformatieverandering
-genetisch gecodeerde calcium sensoren in zenuwcellen -> GFP aan calciumsensitief eiwit
-bij actiepotentialen en invloei calcium -> fluorescentie bij neuronale activiteit
-raam maken in schedel met coverslip en kleurstof
Induceren hersenactiviteit (en gedrag) via kanaal rodopsine
-komen van algen om licht waar te nemen
-induceren in muizen -> door stimulatie met licht openen/sluiten kanalen en cellen krijgen
actiepotentialen, kanaal rodopsine activeert (Ca/Na/H/K instroom) – halorodopsine deactiveert (Cl
instroom)
