Door: Moniek Verhagen
Moleculaire microbiologie Samenvatting
Les 1 + 2 PCR:
Structuur DNA:
- Bestaande uit nucleotiden (met base G-C en A-T)
- Nucleotiden zijn verbonden door Fosfodiesterverbindingen
- Rechtsdraaiende dubbele helix
- Specifieke baseparing door waterstof bruggen
G-C 3 waterstofbruggen
A-T 2 waterstofbruggen
- DNA strengen antiparalel en complementair
- Major en minor groeven
Purine Adenine en Guanine
Pyrimidine Thymine en Cytosine
Nucleotiden bestaan uit:
- Suiker
- Fosfaat (γ-β-α-suiker-base)
- Base
DNA polymerase:
- Template afhankelijk
- Polymerisatie richting 5’3’
- Primer nodig met vrij 3’OH uiteinde
- Exonuclease activiteit 5’3’(primer weghalen)
- Exonuclease activiteit van 3’5’ (proofreading)
Je moet de Sense en de antisense
kunnen herkennen!!
,Door: Moniek Verhagen
RNA polymerase:
- Prokaryoten 1 soort RNA polymerase
- Eukaryoten 3 soorten RNA polymerase
- Polymeriseren van 5’3’
- Gebruiken DNA als template
- Kunnen zelf DNA helices openen (geen helicase nodig!)
- Kunnen verkeerd ingebouwde nucleotiden zelf weghalen
- Geen primer nodig
- Laat bij terminatiesignaal los van DNA template
Laboratoria voor PCR:
Altijd minimaal 3 ruimtes nodig namelijk:
1: Schone ruimte hier staat de mastermix, buffers, reagentia
2: het vieze lab hier heb je bacterien op plaat of het DNA van patientenmonsters
3: PCR ruimte met computer
Evt 4: post PCR hier mogen PCR appjes openen
Reactiemix:
- DNA met target sequentie
- Primerpaar (reverse en forward)
- Alle 4 de dNTPs
20-200 µm van alle 4 de dNTPs te hoge concentratie kan synthese fouten veroorzaken.
- Taq DNA-polymerase hittestabiel, zorgt voor snelle synthese geen 3’ 5’ exonuclease
activiteit dus GEEN proofreading!
- PCR-buffer
Tris-HCL buffer met pH=7.8 is optimaal
- MgCl2 essentiele cofactor voor Taq-polymerase en heeft stabiliserend effect.
Primers:
- Tussen 18-25 nucleotiden lang
- Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC gehalte (40%-70%)
- Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
- Geen basenparing mogelijk tussen de primers zelf (primer-dimer)
- Amplicon tussen 75-200bp voor de hoogste efficientie
- Tm (smelttemperatuur) tussen 50-60 graden
- Annealingstemperatuur (Ta ligt vaak 5°C onderde Tm vd primer) temperatuur waarbij
primers hechten aan template
Probe: Moet eerder op DNA binden dan primer, anders bindt polymease al en is de probe mogelijk te
laat met binden. Probe bindt bij 60-70 graden primer bij 40-50
, Door: Moniek Verhagen
Temperatuurcyclus:
Denaturatie (94 °C): waterstof bruggen worden verbroken
Annealing (50-60°C): hybridisatie van primers met het ssDNA, kan alleen bij lagere temperatuur.
Sequentie moet bekend zijn.
Elongatie (72°C): DNA synthese ssds. Bij optimum temperatuur voor gebruikt DNA polymerase.
Real time PCR/Q PCR:
Voordelen:
- Snel
- Veel monsters in een keer
- Gevoelig
- Mogelijkheid om te kwantificeren
- Lag contiminatie risico (gesloten systeem)
- Multiplex mogelijk
Nadelen:
- Niet ideaal voor multiplexen maar wel mogelijk
- Investering in apperatuur
- RNA labiel!!
- DNA contaminatie (bij mRNA analyse)
De hoeveelheid PCR product in een PCR reactive na een X aantal cycli hangt af van het aantal
startmoleculen in de reactie
Principe Q-PCR:
Door de hoeveelheid PCR product na iedere cyclus te meten is het aantal startmoleculen terug te
berekenen
In werkelijkheid:
hoeveelheid DNA = 2 reactie verloopt steeds minder eficientExponentieel
n
n= aantal cycli
Op lab, reactie steeds
minder efficient
werken
Moleculaire microbiologie Samenvatting
Les 1 + 2 PCR:
Structuur DNA:
- Bestaande uit nucleotiden (met base G-C en A-T)
- Nucleotiden zijn verbonden door Fosfodiesterverbindingen
- Rechtsdraaiende dubbele helix
- Specifieke baseparing door waterstof bruggen
G-C 3 waterstofbruggen
A-T 2 waterstofbruggen
- DNA strengen antiparalel en complementair
- Major en minor groeven
Purine Adenine en Guanine
Pyrimidine Thymine en Cytosine
Nucleotiden bestaan uit:
- Suiker
- Fosfaat (γ-β-α-suiker-base)
- Base
DNA polymerase:
- Template afhankelijk
- Polymerisatie richting 5’3’
- Primer nodig met vrij 3’OH uiteinde
- Exonuclease activiteit 5’3’(primer weghalen)
- Exonuclease activiteit van 3’5’ (proofreading)
Je moet de Sense en de antisense
kunnen herkennen!!
,Door: Moniek Verhagen
RNA polymerase:
- Prokaryoten 1 soort RNA polymerase
- Eukaryoten 3 soorten RNA polymerase
- Polymeriseren van 5’3’
- Gebruiken DNA als template
- Kunnen zelf DNA helices openen (geen helicase nodig!)
- Kunnen verkeerd ingebouwde nucleotiden zelf weghalen
- Geen primer nodig
- Laat bij terminatiesignaal los van DNA template
Laboratoria voor PCR:
Altijd minimaal 3 ruimtes nodig namelijk:
1: Schone ruimte hier staat de mastermix, buffers, reagentia
2: het vieze lab hier heb je bacterien op plaat of het DNA van patientenmonsters
3: PCR ruimte met computer
Evt 4: post PCR hier mogen PCR appjes openen
Reactiemix:
- DNA met target sequentie
- Primerpaar (reverse en forward)
- Alle 4 de dNTPs
20-200 µm van alle 4 de dNTPs te hoge concentratie kan synthese fouten veroorzaken.
- Taq DNA-polymerase hittestabiel, zorgt voor snelle synthese geen 3’ 5’ exonuclease
activiteit dus GEEN proofreading!
- PCR-buffer
Tris-HCL buffer met pH=7.8 is optimaal
- MgCl2 essentiele cofactor voor Taq-polymerase en heeft stabiliserend effect.
Primers:
- Tussen 18-25 nucleotiden lang
- Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC gehalte (40%-70%)
- Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
- Geen basenparing mogelijk tussen de primers zelf (primer-dimer)
- Amplicon tussen 75-200bp voor de hoogste efficientie
- Tm (smelttemperatuur) tussen 50-60 graden
- Annealingstemperatuur (Ta ligt vaak 5°C onderde Tm vd primer) temperatuur waarbij
primers hechten aan template
Probe: Moet eerder op DNA binden dan primer, anders bindt polymease al en is de probe mogelijk te
laat met binden. Probe bindt bij 60-70 graden primer bij 40-50
, Door: Moniek Verhagen
Temperatuurcyclus:
Denaturatie (94 °C): waterstof bruggen worden verbroken
Annealing (50-60°C): hybridisatie van primers met het ssDNA, kan alleen bij lagere temperatuur.
Sequentie moet bekend zijn.
Elongatie (72°C): DNA synthese ssds. Bij optimum temperatuur voor gebruikt DNA polymerase.
Real time PCR/Q PCR:
Voordelen:
- Snel
- Veel monsters in een keer
- Gevoelig
- Mogelijkheid om te kwantificeren
- Lag contiminatie risico (gesloten systeem)
- Multiplex mogelijk
Nadelen:
- Niet ideaal voor multiplexen maar wel mogelijk
- Investering in apperatuur
- RNA labiel!!
- DNA contaminatie (bij mRNA analyse)
De hoeveelheid PCR product in een PCR reactive na een X aantal cycli hangt af van het aantal
startmoleculen in de reactie
Principe Q-PCR:
Door de hoeveelheid PCR product na iedere cyclus te meten is het aantal startmoleculen terug te
berekenen
In werkelijkheid:
hoeveelheid DNA = 2 reactie verloopt steeds minder eficientExponentieel
n
n= aantal cycli
Op lab, reactie steeds
minder efficient
werken
