Lambda PCR
Het Lambda virus is een virus dat leeft in en op E.coli. Met het DNA van het Lambda virus kan
de gevoeligheid van de PCR bepaald worden door verschillende concentraties DNA te
gebruiken. PCR ofwel polymerase ketting reactie is een techniek om buiten de cel DNA te
vermeerderen.
De PCR begint met target DNA wat je wil vermeerderen in dit geval kaal Lambda DNA
waaraan verschillende ingrediënten aan toe zijn gevoegd. Deze ingrediënten zijn DNA
Polymerase, primers, een buffer en DNTP-mix .
Al deze ingrediënten worden in en mix bij elkaar gedaan en worden in de PCR machine
gedaan. Als eerst wordt het verwarmd tot 94°C, Bij 94°C gaat het dubbelstrengs DNA uit
elkaar. Deze stap wordt de denaturatie genoemd.
Vervolgens gaat de temperatuur omlaag naar 55 °C en kunnen de primers met stukjes
complementair DNA binden aan het enkelstrengse DNA. De primers zijn het beginstukje van
het nieuwe stukje DNA. Deze stap wordt annealing genoemd.
De derde stap is het verlengen van de primers. De temperatuur gaat omhoog naar 72 °C . De
DNA polymerase kan de juiste nucleotide uit de DNTP-mix koppelen aan het DNA en zo
wordt er weer dubbelstrengs DNA van gemaakt. De meest voorkomende polymerase is Taq
DNA polymerase en is afkomstig uit een bacterie die in geisers voorkomt waardoor het
enzym heel blijft bij de temperaturen van de PCR. De buffer zorgt voor een optimale
omstandigheid voor de vermeerdering van het DNA. Deze stap wordt de extensie genoemd.
Deze drie stappen zijn samen 1 cyclus. Bij elke cyclus wordt het DNA verdubbeld dus om veel
DNA te krijgen moeten er meerdere cycli plaatsvinden. Je kan hier niet oneindig lang mee
doorgaan want dan raken de ingrediënten uit de mix op. Meestal worden er 30 cycli gedaan.
Na de laatste cyclus blijft de temperatuur nog 10 minuten op 72 °C om alle producten die
nog niet helemaal compleet zijn extra te verlengen.
Als laatste koelt de PCR machine het DNA naar 10 °C en de PCR is klaar. De resultaten van de
PCR kunnen zichtbaar gemaakt worden met behulp van gelelektroforese.
Kolonie PCR
Een kolonie PCR wordt gedaan om een bepaald stuk DNA van een kolonie te vermeerderen.
Bij een kolonie PCR wordt het DNA niet gezuiverd maar wordt de PCR direct uitgevoerd op
de kolonie. In ons geval hebben we de kolonie PCR gebruikt om te controleren of bepaalde
plasmiden zijn ingebouwd in een bacterie.
De PCR begint met target DNA wat je wil vermeerderen in dit geval is dat een beetje van een
kolonie waarin plasmiden zijn getransformeerd in MilliQ water . Aan deze suspensie worden
verschillende ingrediënten toe gevoegd. Deze ingrediënten zijn DNA Polymerase, primers,
een buffer en DNTP-mix . Voor elke verschillende plasmide moeten de juiste primers
gebruikt worden.
Het Lambda virus is een virus dat leeft in en op E.coli. Met het DNA van het Lambda virus kan
de gevoeligheid van de PCR bepaald worden door verschillende concentraties DNA te
gebruiken. PCR ofwel polymerase ketting reactie is een techniek om buiten de cel DNA te
vermeerderen.
De PCR begint met target DNA wat je wil vermeerderen in dit geval kaal Lambda DNA
waaraan verschillende ingrediënten aan toe zijn gevoegd. Deze ingrediënten zijn DNA
Polymerase, primers, een buffer en DNTP-mix .
Al deze ingrediënten worden in en mix bij elkaar gedaan en worden in de PCR machine
gedaan. Als eerst wordt het verwarmd tot 94°C, Bij 94°C gaat het dubbelstrengs DNA uit
elkaar. Deze stap wordt de denaturatie genoemd.
Vervolgens gaat de temperatuur omlaag naar 55 °C en kunnen de primers met stukjes
complementair DNA binden aan het enkelstrengse DNA. De primers zijn het beginstukje van
het nieuwe stukje DNA. Deze stap wordt annealing genoemd.
De derde stap is het verlengen van de primers. De temperatuur gaat omhoog naar 72 °C . De
DNA polymerase kan de juiste nucleotide uit de DNTP-mix koppelen aan het DNA en zo
wordt er weer dubbelstrengs DNA van gemaakt. De meest voorkomende polymerase is Taq
DNA polymerase en is afkomstig uit een bacterie die in geisers voorkomt waardoor het
enzym heel blijft bij de temperaturen van de PCR. De buffer zorgt voor een optimale
omstandigheid voor de vermeerdering van het DNA. Deze stap wordt de extensie genoemd.
Deze drie stappen zijn samen 1 cyclus. Bij elke cyclus wordt het DNA verdubbeld dus om veel
DNA te krijgen moeten er meerdere cycli plaatsvinden. Je kan hier niet oneindig lang mee
doorgaan want dan raken de ingrediënten uit de mix op. Meestal worden er 30 cycli gedaan.
Na de laatste cyclus blijft de temperatuur nog 10 minuten op 72 °C om alle producten die
nog niet helemaal compleet zijn extra te verlengen.
Als laatste koelt de PCR machine het DNA naar 10 °C en de PCR is klaar. De resultaten van de
PCR kunnen zichtbaar gemaakt worden met behulp van gelelektroforese.
Kolonie PCR
Een kolonie PCR wordt gedaan om een bepaald stuk DNA van een kolonie te vermeerderen.
Bij een kolonie PCR wordt het DNA niet gezuiverd maar wordt de PCR direct uitgevoerd op
de kolonie. In ons geval hebben we de kolonie PCR gebruikt om te controleren of bepaalde
plasmiden zijn ingebouwd in een bacterie.
De PCR begint met target DNA wat je wil vermeerderen in dit geval is dat een beetje van een
kolonie waarin plasmiden zijn getransformeerd in MilliQ water . Aan deze suspensie worden
verschillende ingrediënten toe gevoegd. Deze ingrediënten zijn DNA Polymerase, primers,
een buffer en DNTP-mix . Voor elke verschillende plasmide moeten de juiste primers
gebruikt worden.
