Medical Genomics HC’s
HC 1 – Introductie
Bij de werkgroep-opdrachten is aanwezigheid verplicht. Het eindcijfer van de cursus zal worden
bepaald door de werkgroep-opdrachten en het tentamen. De werkgroep-opdrachten bepalen
samen 40% van het eindcijfer. Het tentamen weegt voor 60% mee bij het eindcijfer. Om te
slagen moet je een voldoende (>5.50) hebben voor beide onderdelen. Tentamen is MC, en in
NL. Tentamenstof is stof uit Syllabus; hoofdzaken in HC.
Genoom = al het genetisch materiaal in een organisme. Genomics is de studie van het gehele
genoom (niet alleen humaan). Voor Genomics heb je genetica nodig. Er worden de laatste tijd in
de kliniek steeds meer genome-wide technieken gebruikt. Als Genomics worden toegepast in de
medische sector, noem je het Medical Genomics.
Je hebt genetische diversiteit tussen soorten (door soortvorming), maar ook binnen soorten
(bijv. verschillende huidskleuren mensen). Apen en mensen schelen ongeveer 1% in coderende
gebieden van elkaar. Mensen onderling ongeveer 0,1%. Wat voor persoon je bent, is een
opsomming van Nurture (omgevingsfactoren, bijv. geloof) en Nature (genen, bijv. oogkleur).
Bij Reverse genetics pak je een gen (die ene mutatie), en die
bouw je in in het diermodel. Vervolgens vraag je je af; welk
fenotype past bij dit genotype? Je selecteert dus een gen, en
vind het fenotype.
Bij Forward genetics begin je met een fenotype. Je brengt
random allemaal mutaties aan, je onderzoekt een grote
populatie. Je bekijkt alle proefdieren, en je pakt het dier met de
gewenste afwijking (fenotype) eruit. Vervolgens zoek je uit
welk gen hiervoor zorgt. Forward is een hele krachtige
benadering, maar hier heb je wel veel proefdieren voor nodig. Je selecteert dus een fenotype, en
vind het gen.
De mens heeft ongeveer 30.000 genen, en ongeveer 1 gen per 100.000 basen.
Genetische manipulatietechnieken:
- Knock-out: doe je als je geïnteresseerd bent in een bepaald gen. Je verandert dan een
wildtype allel in een mutant allel. Je kan het allel helemaal uitschakelen (nul-allel; compleet
functieverlies); Knock-out
- Knock-in: je brengt een mutant-allel in in het genoom
- Conditional knock-out: er is in eerste instantie niks aan de hand met de muis, maar je zorgt
dat op een gegeven moment
het gen gaat recombineren,
waardoor er knock-out
plaatsvindt (knock-out vindt
dus plaats door bepaalde
omstandigheden). Hier heb je
een floxed-allel
Pagina 1 van 79
,Medical Genomics HC’s
HC 2 – Fundamentals of molecular genetics
We hebben 23 chromosoom-paren. Dus in totaal 46. Deze zitten allemaal in de celkern. In de
kern zit ongeveer 2 meter aan DNA. Slechts een deel van het DNA is coderend, maar 3%.
Ongeveer 30 000 genen coderen voor eiwitten, deze genen noem je structural genes. DNA is te
vinden in alle eukaryote organismen. Het opvouwen van DNA in de kern gaat m.b.v.
eiwitstructuren, waaronder nucleosomen.
DNA is opgebouwd uit nucleotiden (ongeveer 3 biljoen nucleotideparen), die bestaan uit de
basen Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) en Guanine (G). A en G bestaan uit 2 ringen, C
en T uit 1. Wanneer een base gebonden zit aan een suiker (glucose), heet dit een nucleoside.
Als hier ook een fosfaat aan zit, heet dit een nucleotide. Nucleotiden zijn de bouwstenen van het
DNA, en zijn onderling aan elkaar verbonden d.m.v. fosfordiester-bindingen. 5’ kant is de start
van het DNA; 5’ prime phosphate (kant van de -PO4 groep). Aan de 3’ kant dit de hydroxyl groep
(-OH). Je leest de DNA sequentie dus altijd van 5’ naar 3’ (DNA-synthese is van 5’ → 3’).
Baseparing gaat d.m.v. waterstofbruggen. C bindt met G (3 H-bruggen), en A bindt met T (2 H-
bruggen). De ene streng is antiparallel aan de andere streng.
Een gen is een DNA-code die uiteindelijk codeert voor een eiwit. Gen begint met een startcodon
(bijna altijd ATG), en eindigt met een stopcodon (vaak TAA of TGA). Je kan met programma’s
mogelijke eiwitten zoeken. Je gaat kijken waar de startcodons zitten, en de stopcodons.
Vervolgens ga je kijken of hiertussen gebieden zitten die zouden kunnen coderen voor een eiwit.
Je kan dan een overzicht krijgen van potentiele genen. Een gen begint meestal met een
promotor (hier bindt RNApolymerase). Ook deze kan je zoeken m.b.v. programma’s.
Het DNA van prokaryoten (bijv. bacteriën) zijn opgebouwd uit units, waarbij meerdere genen tot
expressie komen onder de controle van 1 promotor. Deze opbouw is in operonen. Dan krijg je
polycistronic mRNA; 1 groot messengerRNA met de code erop van de (bijv.) 5 genen. Je hebt
weinig RNA processing. Ook zit het DNA niet in de kern, maar in het cytoplasma.
Pagina 2 van 79
,Medical Genomics HC’s
Het DNA van eukaryoten zit in de kern. Er zijn
geen operonen, maar single genes. Dus je
krijgt vervolgens monocistronic mRNAs; 1
RNA gaat het ribosoom in en wordt vertaald.
DNA is vaak opgebouwd uit exonen
(coderende deel) en intronen → er vindt veel
RNA processing plaats. Zowel intronen als
exonen worden transcribed in mRNA, maar
voordat dit aankomt in het ribosoom vind er splicing plaats. De intronen worden eruit geknipt, en
de exonen aan elkaar geplakt. Dit is het ‘mature’
mRNA, dat het ribosoom in gaat.
Alternative RNA splicing: Soms vindt splicing anders
plaats, waardoor exonen ook eruit gespliced
worden. Het gevolg is dat je een ander mRNA over
houdt, waardoor je ook uiteindelijk een ander eiwit
krijgt, met dus ook een andere functie. Je kan dus
uit je 30 000 genen meer dan 30 000 soorten
eiwitten maken.
Processed eukaryote messages bevatten een poly(A) addition signal (AAUAAA) (ook wel
poly(A) site genoemd) aan het 3’ einde. Dit draagt bij aan transcriptieterminatie, en het loslaten
van RNApolymerase van het DNA-template. Het nieuwe gevormde, of nascante RNA, ondergaat
nog verdere modificaties waarna het mRNA is. Deze modificaties heten post-transcriptional
modifications.
Van DNA → RNA noem je transcriptie, vindt plaats in kern. RNA → eiwit noem je translatie, en
vindt plaats in plasma. Het Centrale Dogma stelt dat genetische informatie stroomt van DNA →
RNA → eiwit, en niet anders. RNA heeft U i.p.v. T.
RNApolymerase bindt aan bindingsplaats op het DNA (transcriptie-initiatie-site; promoter). Over
het algemeen zitten er 2 ‘promoter sequenties’ upstream van het begin van elk gen. Hij leest het
van 3’ naar 5’. Hij maakt een mRNA van 5’ naar 3’. Dan vindt de omzetting plaats van DNA →
mRNA. Uiteindelijk komt RNApolymerase op een transcriptietermiminatie-site, en stopt hij met
transcriptie.
Translatie: het mRNA gaat uit de nucleus, en komt bij een ribosoom, die aminozuren aan elkaar
gaat binden m.b.v. tRNA. Hij leest het in codons (per drie basen). Meerdere typen codons
kunnen coderen voor hetzelfde aminozuur. Het mRNA komt vast aan het ribosoom bij het
mRNA’s translatie-start-signaal; AUG. Vervolgens worden de volgende codons afgelezen en zo
de juiste aminozuren aan elkaar gezet (elongation). Dit proces gaat door totdat er een
stopcodon (UAG,
UGA of UAA)
komt.
Pagina 3 van 79
,Medical Genomics HC’s
Het startsignaal is dus AUG, wat
codeert voor methionine (M). Maar
niet elk eiwit start hier uiteindelijk
mee, omdat hij er vaak wordt
afgeknipt in verdere processing. Als
het eerste ‘geladen’ tRNA in de A-
site zit van het ribosoom, schuift het
ribosoom verder zodat het tRNA nu
in de P-site zit. Nieuwe geladen
tRNAs komen dus binnen via de A-
site, waar de binding tussen de
aminozuren wordt gevormd.
Er zijn 20 soorten aminozuren. Ze
hebben allemaal een karakteristieke groep, die de eigenschappen geeft aan de aminozuren. Ze
hebben allemaal een centrale koolstof, met daaraan een aminogroep (NH2) en een
carboxylgroep (COOH). De aminogroep is de linkerkant/beginkant van het eiwit. De
carboxylgroep zit aan de rechterkant/eindkant van het eiwit. De meeste aminozuren hebben ook
nog een karakteristieke zijgroep, aangeduid met R. De binding van 2 aminozuren vindt plaats
d.m.v. condensatie; er wordt water afgesplitst. Hier heb je een enzym voor nodig, dit enzym is
het ribosoom. Deze wordt geholpen door tRNAs. Zij zorgen ervoor dat het aminozuur op de
juiste plek wordt ingebouwd. Er wordt vaak onderscheid gemaakt tussen aminozuren o.b.v.:
hydrofobiteit, grootte, lading, secundaire structuur voorkeur, aromaticiteit, en alcoholiciteit. Er is
een verband tussen de secundaire structuur voorkeur van aminozuren, en de fysisch-chemische
karakteristieken. De beta-vertakte residuen (Ile, Thr en Val) zitten graag in beta-strands. Asp,
Asn, Gly, Pro en Ser zitten graag in coils. Aminozuren die in een alfahelix zitten zijn vaak
hydrofoob, en zitten het liefst in een helix (dit zijn Ala, Leu, Met, Trp, Val en Phe).
Eiwitstructuren
- Primaire structuur: de keten met de aminozuren. Aminozuren kunnen aan elkaar vastraken
als van de ene een watergroep afscheid van de caboxylgroep, en van de ander de
aminogroep (intotaal 1 water afgescheiden, condensatiereactie). Er vormt dan een
peptidebinding: dubbel gebonden O, N, H. Polypeptide = meerdere aminozuren aan elkaar.
Deze binding kan weer verbroken worden bij een hydrolysereactie.
- Dit gaat zich vouwen o.b.v. de lading, en de structuur van de
aminozuren. Door de vorming van H-bruggen vormt zich de
secundaire structuur. Deze bestaat uit beta sheets, alpha
helixen, en coils. Er is een bepaalde voorkeur voor aminozuren
die betasheets vormen; sommige vormen het graag en
anderen niet. Anderen vinden het weer prettig om in een
alfahelix te zitten. De waterstofbruggen-paring bij betasheets
vindt plaats tussen aminozuren die op verschillende ‘treden’
zitten. Helix breakers; verstoren de helix een beetje.
- Tertiaire structuur is met alle dingen erbij; soms hebben eiwitten bepaalde structuren nodig.
Wordt ook wel functionele eiwitstructuur genoemd. Is dus het hele eiwit, inclusief cofactoren
en zijketens. Quarternary structuur; een eiwit met subeenheden; eiwitcomplex. Een
quarternary structuur bestaat dus uit meer dan één aminozuurketen.
Pagina 4 van 79
,Medical Genomics HC’s
Bijna al het werk in levende cellen wordt gedaan door eiwitten. Er zijn in elke cel verschillende
soorten eiwitten:
- Enzymen
o Katalyseren reacties
- Structurele componenten
o Geven cellen vorm en helpen ze bewegen
- Transporteiwitten
o Dragen zuurstof en andere kleine moleculen
- Signaaltransductie-eiwitten
o Sturen signalen door om biologische processen tussen omgeving en DNA, en tussen
verschillende cellen/weefsels/organen te coördineren
- Regulatoire eiwitten
o Reguleren DNA expressie door herkenning van specifieke sequenties en hieraan te binden
- Membraanstransporters
o Zorgen voor het transport van moleculen over hydrofobe membranen
- Hormonen
o Sturen signalen door het gehele lichaam
- Antilichamen
o Herkennen lichaamsvreemde moleculen
Verschillen tussen genomics en recombinante-DNA technieken zijn dat (1) genomics high-
throughput aanpakken gebruikt waardoor er meer analyses gemaakt kunnen worden, en dat (2)
bij genomics veel grotere datasets gegenereerd worden, waardoor het meer afhankelijk wordt
van computeranalyses.
DNA-analyse
Het halen van DNA uit cellen is een vrij gemakkelijk proces, en gebeurt door enzymen (die van
nature voorkomen) die eiwitten, RNA en andere cellulaire componenten afbreken. Hierdoor blijft
alleen DNA over.
Een vector is een DNA-molecuul die als functie een ander stuk/meerdere andere stukken DNA
dragen heeft. Libraries zijn DNA-fragmenten die gekloneerd worden in een plasmide of vector.
Libraries worden meestal al gemaakt voordat er gesequenced wordt.
Transfer in een bacterie
Eerst moet er van de bacterie een competente cel worden gemaakt; het buitenste membraam
moet permeabel zijn voor DNA. Vervolgens wordt het DNA toegevoegd aan het competente
cellen-mengsel, waardoor het DNA vast gaat zitten aan hun oppervlak. De cellen worden voor
een korte periode hoog verhit, waardoor ze in shock komen en het DNA opnemen. De bacteriën
mogen vervolgens even ‘herstellen’ op een medium, waarna ze op een medium worden
uitgesmeerd met een antibiotica (plating on selective media). Dit antibiotica is hetzelfde als waar
het ingebrachte DNA-resistentie voor toont. Hierdoor blijven alleen de bacteriën die het plasmide
hebben opgenomen in leven op het selectieve medium.
Sanger sequencing (labelled-primer method)
Gebruikt mix van gewone nucleotiden (dNTPs) en dideoxy analogen → ddNTPs. ddNTPs
kunnen niet verlengt worden (terminator). ddNTPs zijn gelabeled (radioactief/fluorescent).
Pagina 5 van 79
, Medical Genomics HC’s
Reactie geeft een verzameling gelabelde fragmenten.
Eerst moet het DNA als single-strand aanwezig zijn.
Er wordt een mix gemaakt van de singlestrand DNA
waarvan je de sequentie wilt weten, DNA
polymerase, 4 deoxyribonucleotides A T G en C
(dNTPs), de 4 dideoxy nucleotides, en een enkele
korte DNA-primer. De primer heeft een nucleotide-
volgorde die complementair is aan de 3’ kant van het
te sequencen (de single-strand) DNA. Er wordt 4x
even veel van deze mixen gemaakt, en dan bij elke mix met een ander gelabeld nucleotide
(A/T/G/C). Als de sequentie dan gerepliceerd wordt door polymerase, en er wordt zo’n gelabeld
nucleotide ingebracht, kan er geen nieuwe nucleotide meer aan gekoppeld worden (replicatie
stopt). Deze gelabelde nucleotiden hebben namelijk geen vrije OH. Zo krijg je in elke mix dus
meerdere kleine stukken gerepliceerd DNA. Deze mixen worden dan opgebracht op een gel, die
ze scheidt op grootte en nucleotide-type. Het kleinste fragment gaat het meest ver door de gel.
Zo kan je uiteindelijk aflezen wat complementair is aan de gewenste sequentie, en dus ook wat
de gewenste sequentie is.
Dye-terminator sequencing
Deze techniek wordt tegenwoordig het meest toegepast, hij is namelijk erg snel. Dit komt
doordat, in tegenstelling tot bij de Sanger-techniek, hier gesequenced wordt in een enkele
reactie. Elk van de vier dideoxynucleotides is namelijk gelabelled met een fluorescente dye, die
licht geeft op elk een andere golflengte. Deze methode geeft zelfde output als bij Sanger (↑), of
kan geanalyseerd worden m.b.v.
een computer (afb →).
Sequentie bepalen van DNA
gebeurt m.b.v. genomic libraries. Je
kan een plasmide maken, en
inbrengen in een cel. Zo kan je een
recombinant plasmide bewaren. En
de cel zal groeien, waardoor er
meerdere plasmiden gemaakt
worden. Maar wat is nou precies de
code van het DNA? Je hebt 4 reageerbuisjes met het onbekende stuk DNA. Hier wordt een
dideoxy C/G/T/A toegevoegd. Dit is een codon dat ingebouwd wordt, en als het eenmaal
ingebouwd is kan het stuk DNA niet meer verder groeien. Er wordt in elke reageerbuis een
DNApolymerase, nucleotiden en een primer toegevoegd. Op het moment dat er een didioxy
wordt ingebouwd, kan er geen polymerisatie meer plaatsvinden. Je hebt dan dus allemaal
fragmenten die eindigen op je bepaalde nucleotide. Deze worden dan gedaan in een gel, waar
ze op grootte gescheiden worden. De kleinste fragmenten gaan het verst door de gel. Deze
techniek is de Sanger-techniek. Dit kan je met de fluorescentiedetector, die de sequentie af kan
lezen.
Whole genome sequencing
1. Je isoleert het DNA; heel genoom
2. Je maakt er fragmenten van
3. Je kan van deze fragmenten een fysische kaart maken, of het kloneren in vectoren
Pagina 6 van 79
HC 1 – Introductie
Bij de werkgroep-opdrachten is aanwezigheid verplicht. Het eindcijfer van de cursus zal worden
bepaald door de werkgroep-opdrachten en het tentamen. De werkgroep-opdrachten bepalen
samen 40% van het eindcijfer. Het tentamen weegt voor 60% mee bij het eindcijfer. Om te
slagen moet je een voldoende (>5.50) hebben voor beide onderdelen. Tentamen is MC, en in
NL. Tentamenstof is stof uit Syllabus; hoofdzaken in HC.
Genoom = al het genetisch materiaal in een organisme. Genomics is de studie van het gehele
genoom (niet alleen humaan). Voor Genomics heb je genetica nodig. Er worden de laatste tijd in
de kliniek steeds meer genome-wide technieken gebruikt. Als Genomics worden toegepast in de
medische sector, noem je het Medical Genomics.
Je hebt genetische diversiteit tussen soorten (door soortvorming), maar ook binnen soorten
(bijv. verschillende huidskleuren mensen). Apen en mensen schelen ongeveer 1% in coderende
gebieden van elkaar. Mensen onderling ongeveer 0,1%. Wat voor persoon je bent, is een
opsomming van Nurture (omgevingsfactoren, bijv. geloof) en Nature (genen, bijv. oogkleur).
Bij Reverse genetics pak je een gen (die ene mutatie), en die
bouw je in in het diermodel. Vervolgens vraag je je af; welk
fenotype past bij dit genotype? Je selecteert dus een gen, en
vind het fenotype.
Bij Forward genetics begin je met een fenotype. Je brengt
random allemaal mutaties aan, je onderzoekt een grote
populatie. Je bekijkt alle proefdieren, en je pakt het dier met de
gewenste afwijking (fenotype) eruit. Vervolgens zoek je uit
welk gen hiervoor zorgt. Forward is een hele krachtige
benadering, maar hier heb je wel veel proefdieren voor nodig. Je selecteert dus een fenotype, en
vind het gen.
De mens heeft ongeveer 30.000 genen, en ongeveer 1 gen per 100.000 basen.
Genetische manipulatietechnieken:
- Knock-out: doe je als je geïnteresseerd bent in een bepaald gen. Je verandert dan een
wildtype allel in een mutant allel. Je kan het allel helemaal uitschakelen (nul-allel; compleet
functieverlies); Knock-out
- Knock-in: je brengt een mutant-allel in in het genoom
- Conditional knock-out: er is in eerste instantie niks aan de hand met de muis, maar je zorgt
dat op een gegeven moment
het gen gaat recombineren,
waardoor er knock-out
plaatsvindt (knock-out vindt
dus plaats door bepaalde
omstandigheden). Hier heb je
een floxed-allel
Pagina 1 van 79
,Medical Genomics HC’s
HC 2 – Fundamentals of molecular genetics
We hebben 23 chromosoom-paren. Dus in totaal 46. Deze zitten allemaal in de celkern. In de
kern zit ongeveer 2 meter aan DNA. Slechts een deel van het DNA is coderend, maar 3%.
Ongeveer 30 000 genen coderen voor eiwitten, deze genen noem je structural genes. DNA is te
vinden in alle eukaryote organismen. Het opvouwen van DNA in de kern gaat m.b.v.
eiwitstructuren, waaronder nucleosomen.
DNA is opgebouwd uit nucleotiden (ongeveer 3 biljoen nucleotideparen), die bestaan uit de
basen Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) en Guanine (G). A en G bestaan uit 2 ringen, C
en T uit 1. Wanneer een base gebonden zit aan een suiker (glucose), heet dit een nucleoside.
Als hier ook een fosfaat aan zit, heet dit een nucleotide. Nucleotiden zijn de bouwstenen van het
DNA, en zijn onderling aan elkaar verbonden d.m.v. fosfordiester-bindingen. 5’ kant is de start
van het DNA; 5’ prime phosphate (kant van de -PO4 groep). Aan de 3’ kant dit de hydroxyl groep
(-OH). Je leest de DNA sequentie dus altijd van 5’ naar 3’ (DNA-synthese is van 5’ → 3’).
Baseparing gaat d.m.v. waterstofbruggen. C bindt met G (3 H-bruggen), en A bindt met T (2 H-
bruggen). De ene streng is antiparallel aan de andere streng.
Een gen is een DNA-code die uiteindelijk codeert voor een eiwit. Gen begint met een startcodon
(bijna altijd ATG), en eindigt met een stopcodon (vaak TAA of TGA). Je kan met programma’s
mogelijke eiwitten zoeken. Je gaat kijken waar de startcodons zitten, en de stopcodons.
Vervolgens ga je kijken of hiertussen gebieden zitten die zouden kunnen coderen voor een eiwit.
Je kan dan een overzicht krijgen van potentiele genen. Een gen begint meestal met een
promotor (hier bindt RNApolymerase). Ook deze kan je zoeken m.b.v. programma’s.
Het DNA van prokaryoten (bijv. bacteriën) zijn opgebouwd uit units, waarbij meerdere genen tot
expressie komen onder de controle van 1 promotor. Deze opbouw is in operonen. Dan krijg je
polycistronic mRNA; 1 groot messengerRNA met de code erop van de (bijv.) 5 genen. Je hebt
weinig RNA processing. Ook zit het DNA niet in de kern, maar in het cytoplasma.
Pagina 2 van 79
,Medical Genomics HC’s
Het DNA van eukaryoten zit in de kern. Er zijn
geen operonen, maar single genes. Dus je
krijgt vervolgens monocistronic mRNAs; 1
RNA gaat het ribosoom in en wordt vertaald.
DNA is vaak opgebouwd uit exonen
(coderende deel) en intronen → er vindt veel
RNA processing plaats. Zowel intronen als
exonen worden transcribed in mRNA, maar
voordat dit aankomt in het ribosoom vind er splicing plaats. De intronen worden eruit geknipt, en
de exonen aan elkaar geplakt. Dit is het ‘mature’
mRNA, dat het ribosoom in gaat.
Alternative RNA splicing: Soms vindt splicing anders
plaats, waardoor exonen ook eruit gespliced
worden. Het gevolg is dat je een ander mRNA over
houdt, waardoor je ook uiteindelijk een ander eiwit
krijgt, met dus ook een andere functie. Je kan dus
uit je 30 000 genen meer dan 30 000 soorten
eiwitten maken.
Processed eukaryote messages bevatten een poly(A) addition signal (AAUAAA) (ook wel
poly(A) site genoemd) aan het 3’ einde. Dit draagt bij aan transcriptieterminatie, en het loslaten
van RNApolymerase van het DNA-template. Het nieuwe gevormde, of nascante RNA, ondergaat
nog verdere modificaties waarna het mRNA is. Deze modificaties heten post-transcriptional
modifications.
Van DNA → RNA noem je transcriptie, vindt plaats in kern. RNA → eiwit noem je translatie, en
vindt plaats in plasma. Het Centrale Dogma stelt dat genetische informatie stroomt van DNA →
RNA → eiwit, en niet anders. RNA heeft U i.p.v. T.
RNApolymerase bindt aan bindingsplaats op het DNA (transcriptie-initiatie-site; promoter). Over
het algemeen zitten er 2 ‘promoter sequenties’ upstream van het begin van elk gen. Hij leest het
van 3’ naar 5’. Hij maakt een mRNA van 5’ naar 3’. Dan vindt de omzetting plaats van DNA →
mRNA. Uiteindelijk komt RNApolymerase op een transcriptietermiminatie-site, en stopt hij met
transcriptie.
Translatie: het mRNA gaat uit de nucleus, en komt bij een ribosoom, die aminozuren aan elkaar
gaat binden m.b.v. tRNA. Hij leest het in codons (per drie basen). Meerdere typen codons
kunnen coderen voor hetzelfde aminozuur. Het mRNA komt vast aan het ribosoom bij het
mRNA’s translatie-start-signaal; AUG. Vervolgens worden de volgende codons afgelezen en zo
de juiste aminozuren aan elkaar gezet (elongation). Dit proces gaat door totdat er een
stopcodon (UAG,
UGA of UAA)
komt.
Pagina 3 van 79
,Medical Genomics HC’s
Het startsignaal is dus AUG, wat
codeert voor methionine (M). Maar
niet elk eiwit start hier uiteindelijk
mee, omdat hij er vaak wordt
afgeknipt in verdere processing. Als
het eerste ‘geladen’ tRNA in de A-
site zit van het ribosoom, schuift het
ribosoom verder zodat het tRNA nu
in de P-site zit. Nieuwe geladen
tRNAs komen dus binnen via de A-
site, waar de binding tussen de
aminozuren wordt gevormd.
Er zijn 20 soorten aminozuren. Ze
hebben allemaal een karakteristieke groep, die de eigenschappen geeft aan de aminozuren. Ze
hebben allemaal een centrale koolstof, met daaraan een aminogroep (NH2) en een
carboxylgroep (COOH). De aminogroep is de linkerkant/beginkant van het eiwit. De
carboxylgroep zit aan de rechterkant/eindkant van het eiwit. De meeste aminozuren hebben ook
nog een karakteristieke zijgroep, aangeduid met R. De binding van 2 aminozuren vindt plaats
d.m.v. condensatie; er wordt water afgesplitst. Hier heb je een enzym voor nodig, dit enzym is
het ribosoom. Deze wordt geholpen door tRNAs. Zij zorgen ervoor dat het aminozuur op de
juiste plek wordt ingebouwd. Er wordt vaak onderscheid gemaakt tussen aminozuren o.b.v.:
hydrofobiteit, grootte, lading, secundaire structuur voorkeur, aromaticiteit, en alcoholiciteit. Er is
een verband tussen de secundaire structuur voorkeur van aminozuren, en de fysisch-chemische
karakteristieken. De beta-vertakte residuen (Ile, Thr en Val) zitten graag in beta-strands. Asp,
Asn, Gly, Pro en Ser zitten graag in coils. Aminozuren die in een alfahelix zitten zijn vaak
hydrofoob, en zitten het liefst in een helix (dit zijn Ala, Leu, Met, Trp, Val en Phe).
Eiwitstructuren
- Primaire structuur: de keten met de aminozuren. Aminozuren kunnen aan elkaar vastraken
als van de ene een watergroep afscheid van de caboxylgroep, en van de ander de
aminogroep (intotaal 1 water afgescheiden, condensatiereactie). Er vormt dan een
peptidebinding: dubbel gebonden O, N, H. Polypeptide = meerdere aminozuren aan elkaar.
Deze binding kan weer verbroken worden bij een hydrolysereactie.
- Dit gaat zich vouwen o.b.v. de lading, en de structuur van de
aminozuren. Door de vorming van H-bruggen vormt zich de
secundaire structuur. Deze bestaat uit beta sheets, alpha
helixen, en coils. Er is een bepaalde voorkeur voor aminozuren
die betasheets vormen; sommige vormen het graag en
anderen niet. Anderen vinden het weer prettig om in een
alfahelix te zitten. De waterstofbruggen-paring bij betasheets
vindt plaats tussen aminozuren die op verschillende ‘treden’
zitten. Helix breakers; verstoren de helix een beetje.
- Tertiaire structuur is met alle dingen erbij; soms hebben eiwitten bepaalde structuren nodig.
Wordt ook wel functionele eiwitstructuur genoemd. Is dus het hele eiwit, inclusief cofactoren
en zijketens. Quarternary structuur; een eiwit met subeenheden; eiwitcomplex. Een
quarternary structuur bestaat dus uit meer dan één aminozuurketen.
Pagina 4 van 79
,Medical Genomics HC’s
Bijna al het werk in levende cellen wordt gedaan door eiwitten. Er zijn in elke cel verschillende
soorten eiwitten:
- Enzymen
o Katalyseren reacties
- Structurele componenten
o Geven cellen vorm en helpen ze bewegen
- Transporteiwitten
o Dragen zuurstof en andere kleine moleculen
- Signaaltransductie-eiwitten
o Sturen signalen door om biologische processen tussen omgeving en DNA, en tussen
verschillende cellen/weefsels/organen te coördineren
- Regulatoire eiwitten
o Reguleren DNA expressie door herkenning van specifieke sequenties en hieraan te binden
- Membraanstransporters
o Zorgen voor het transport van moleculen over hydrofobe membranen
- Hormonen
o Sturen signalen door het gehele lichaam
- Antilichamen
o Herkennen lichaamsvreemde moleculen
Verschillen tussen genomics en recombinante-DNA technieken zijn dat (1) genomics high-
throughput aanpakken gebruikt waardoor er meer analyses gemaakt kunnen worden, en dat (2)
bij genomics veel grotere datasets gegenereerd worden, waardoor het meer afhankelijk wordt
van computeranalyses.
DNA-analyse
Het halen van DNA uit cellen is een vrij gemakkelijk proces, en gebeurt door enzymen (die van
nature voorkomen) die eiwitten, RNA en andere cellulaire componenten afbreken. Hierdoor blijft
alleen DNA over.
Een vector is een DNA-molecuul die als functie een ander stuk/meerdere andere stukken DNA
dragen heeft. Libraries zijn DNA-fragmenten die gekloneerd worden in een plasmide of vector.
Libraries worden meestal al gemaakt voordat er gesequenced wordt.
Transfer in een bacterie
Eerst moet er van de bacterie een competente cel worden gemaakt; het buitenste membraam
moet permeabel zijn voor DNA. Vervolgens wordt het DNA toegevoegd aan het competente
cellen-mengsel, waardoor het DNA vast gaat zitten aan hun oppervlak. De cellen worden voor
een korte periode hoog verhit, waardoor ze in shock komen en het DNA opnemen. De bacteriën
mogen vervolgens even ‘herstellen’ op een medium, waarna ze op een medium worden
uitgesmeerd met een antibiotica (plating on selective media). Dit antibiotica is hetzelfde als waar
het ingebrachte DNA-resistentie voor toont. Hierdoor blijven alleen de bacteriën die het plasmide
hebben opgenomen in leven op het selectieve medium.
Sanger sequencing (labelled-primer method)
Gebruikt mix van gewone nucleotiden (dNTPs) en dideoxy analogen → ddNTPs. ddNTPs
kunnen niet verlengt worden (terminator). ddNTPs zijn gelabeled (radioactief/fluorescent).
Pagina 5 van 79
, Medical Genomics HC’s
Reactie geeft een verzameling gelabelde fragmenten.
Eerst moet het DNA als single-strand aanwezig zijn.
Er wordt een mix gemaakt van de singlestrand DNA
waarvan je de sequentie wilt weten, DNA
polymerase, 4 deoxyribonucleotides A T G en C
(dNTPs), de 4 dideoxy nucleotides, en een enkele
korte DNA-primer. De primer heeft een nucleotide-
volgorde die complementair is aan de 3’ kant van het
te sequencen (de single-strand) DNA. Er wordt 4x
even veel van deze mixen gemaakt, en dan bij elke mix met een ander gelabeld nucleotide
(A/T/G/C). Als de sequentie dan gerepliceerd wordt door polymerase, en er wordt zo’n gelabeld
nucleotide ingebracht, kan er geen nieuwe nucleotide meer aan gekoppeld worden (replicatie
stopt). Deze gelabelde nucleotiden hebben namelijk geen vrije OH. Zo krijg je in elke mix dus
meerdere kleine stukken gerepliceerd DNA. Deze mixen worden dan opgebracht op een gel, die
ze scheidt op grootte en nucleotide-type. Het kleinste fragment gaat het meest ver door de gel.
Zo kan je uiteindelijk aflezen wat complementair is aan de gewenste sequentie, en dus ook wat
de gewenste sequentie is.
Dye-terminator sequencing
Deze techniek wordt tegenwoordig het meest toegepast, hij is namelijk erg snel. Dit komt
doordat, in tegenstelling tot bij de Sanger-techniek, hier gesequenced wordt in een enkele
reactie. Elk van de vier dideoxynucleotides is namelijk gelabelled met een fluorescente dye, die
licht geeft op elk een andere golflengte. Deze methode geeft zelfde output als bij Sanger (↑), of
kan geanalyseerd worden m.b.v.
een computer (afb →).
Sequentie bepalen van DNA
gebeurt m.b.v. genomic libraries. Je
kan een plasmide maken, en
inbrengen in een cel. Zo kan je een
recombinant plasmide bewaren. En
de cel zal groeien, waardoor er
meerdere plasmiden gemaakt
worden. Maar wat is nou precies de
code van het DNA? Je hebt 4 reageerbuisjes met het onbekende stuk DNA. Hier wordt een
dideoxy C/G/T/A toegevoegd. Dit is een codon dat ingebouwd wordt, en als het eenmaal
ingebouwd is kan het stuk DNA niet meer verder groeien. Er wordt in elke reageerbuis een
DNApolymerase, nucleotiden en een primer toegevoegd. Op het moment dat er een didioxy
wordt ingebouwd, kan er geen polymerisatie meer plaatsvinden. Je hebt dan dus allemaal
fragmenten die eindigen op je bepaalde nucleotide. Deze worden dan gedaan in een gel, waar
ze op grootte gescheiden worden. De kleinste fragmenten gaan het verst door de gel. Deze
techniek is de Sanger-techniek. Dit kan je met de fluorescentiedetector, die de sequentie af kan
lezen.
Whole genome sequencing
1. Je isoleert het DNA; heel genoom
2. Je maakt er fragmenten van
3. Je kan van deze fragmenten een fysische kaart maken, of het kloneren in vectoren
Pagina 6 van 79
