1e Ba BMW – histologie
Hoofdstuk 1: Waarnemingsmethoden .................................................................................................... 2
Hoofdstuk 2: Epitheel .............................................................................................................................. 7
Hoofdstuk 3: Bindweefsel ..................................................................................................................... 14
Hoofdstuk 4: Vetweefsel ....................................................................................................................... 21
Hoofdstuk 5: Kraakbeen ........................................................................................................................ 23
Hoofdstuk 6: Bot.................................................................................................................................... 26
Hoofdstuk 7: Bloed en Hemopoëse....................................................................................................... 33
Hoofdstuk 8: Spierweefsel .................................................................................................................... 48
Hoofdstuk 9: Zenuwweefsel .................................................................................................................. 53
Hoofdstuk 10: Zintuigen ........................................................................................................................ 64
Hoofdstuk 11: Huid................................................................................................................................ 76
Hoofdstuk 12: Signaaltransductie ......................................................................................................... 81
1
,Hoofdstuk 1: Waarnemingsmethoden
Inleiding
Weefsel = cellen + intercellulaire vloeistof + intercellulaire matrix.
Intercellulaire matrix = collageen en andere eiwitten en is een plaats voor interactie tussen cellen.
Weefselvoorbereiding
Een weefsel kan bijna nooit meteen onder een microscoop worden gelegd. Men gaat het dus eerst
moeten voorbereiden.
1. Het weefsel wordt gefixeerd en ingebed voordat het gesneden kan worden
2. De coupes zijn meestal niet fel gekleurd en zo moeilijk te bestuderen, vandaar dat men die
coupes gaat kleuren.
3. Tijdens de voorbereiding kunnen artefacten optreden.
Fixatie
De fixatie stopt het metabolisme van de cel. Men gaat chemicaliën gebruiken, deze zorgen ervoor dat
crosslinken denatureren en onwerkzaam maken van de enzymen, structurele proteïnen en
fosfolipiden niet meer gebeuren.
Cellen en weefsel moeten zo vers mogelijk gefixeerd worden. Dit kan door bevriezing, want cellen
bevatten veel water.
1. Fixatie bij lichtmicroscopie: Formaldehyde
2. Fixatie bij elektronenmicroscopie: glutaraldehyde / osmiumtetroxide
Fixatie elektronenmicroscopie: men gebruikt vaak een dubbele fixatie. Eerst gebruikt men
glutaaraldehyde, dit voorkomt volumeveranderingen is de cel. Daarna gaat men gebruikt maken van
osmiumtetroxide dat instaat voor het fixeren en crosslinken van onverzadigde banden in vetzuren.
Immersie weefsel wordt ondergedompeld in de vloeistoffen
Perfusie via de bloedvaten van het orgaan (betere methode)
Inbedding
Deze stap gebeurt om het weefsel goed te kunnen snijden.
Lichtmicroscopisch
1. Dehydratie weefsel in vloeistof met een alcohol percentage van 30-100%
2. Impregnatie In vloeibare parafine van 60°C, die stolt, er kunnen coupes worden gesneden.
3. Snijden coupes van 5 micrometer, door een stalen mes (microtoom)
4. Volgende stap gestrekt, op objectglaasje, gedeparaffineerd, gekleurd en dekglaasje
Elektronenmicroscoop
1. Dehydratie weefsel in vloeistof met een alcohol percentage van 30-100%
2. Inbedding epoxyharsen (harder, zodat dunnere coupes gesneden kunnen worden)
3. Snijden 50–100 nm door middel van een ultramicrotoom (glazen of diamanten mes)
4. Contrasteren men legt een druppel met Pd of uranylionen op de coupe
2
,Kleuring
Lichtmicroscoop: haematoxyline (basisch – basofiele nucleïnezuren DNA en RNA)
Eosine (Zuur – acidofiele eiwitten)
Insluiten in hars en afdekken met dekglas
Elektronenmicroscoop: contrasteren met Uranylacetaat of loodnitraat.
Lichtmicroscopen
Oplossend vermogen = resolutie
Het oplossend vermogen is de kleinste afstand waar 2 punten afzonderlijk waar worden genomen.
Een belangrijke specificatie van een object is de numerieke apparatuur.
De numerieke apparatuur bij een Lichtmicroscoop = 0,25 𝜇m (kleiner wordt niet waargenomen). Dit
zorgt ervoor dat organellen enkel zichtbaar zijn in een goede coupe.
De specificaties van een objectief is op de zijkant te zien: de vergroting, NA, tubuslengte en de
correlatie voor de dekglasdikte.
Fasecontrastmicroscoop
Dit is een techniek/microscoop waarbij ongekleurde preparaten worden bekeken. Er wordt een
zichtbaar beeld gevormd door faseveranderingen die ontstaan door kleine brekingsverschillen. Dit
zorgt voor variaties van licht en donker.
Interferentiecontrast
Kan ook toegepast worden bij ongekleurde preparaten. Hier wordt gebruik gemaakt van de
fasevertragingen die optreden wanneer het licht door get preparaat valt. Dit zorgt voor een
reliëfvormen en zo zijn andere structuren hier duidelijker aangetoond.
Polarisatiemicroscoop
Hier gaat men anisotrope structuren bekijken (spierfibrillen, collagene vezels, lensvezels,…). Deze
hebben het vermogen op licht te polariseren. Men gaat dus gebruik maken van 2 polarisatiefilters. De
eerste onder de condensator en de 2e tussen het objectief en de analysator.
Fluorecentiemicroscoop
Cellen of weefsel kunnen fluorescent gemaakt worden, maar ook als van nature fluorescent zijn
(Vitamine K). Door deze techniek is het mogelijk om fysiologische en biochemische processen te
bestuderen. Deze microscoop heeft een digitale camera zodat er geen licht verloren gaat en er een
duidelijker beeld gevormd kan worden.
Confocale laser-scanning microscoop CLSM
Alle fluorescente delen in een preparaat zullen zichtbaar zijn = kan wazig worden. Deze microscoop
gaat het preparaat lijn per lijn lezen. Het laat dan ook enkel het licht door waarop het gefocust is. De
plaats waar het licht doorkomt is de pinhole. De hoeveelheid licht dat de pinhole passeert wordt
gemeten door een fotomultiplierbuis. Dit wordt gedigitaliseerd en in een grafiek weergegeven. De
resolutie hier is 18 𝜇m. Door de digitale opvolging wordt een 3D beeld gevormd op de computer.
Superresolutiemicroscoop
Dit is een vorm van lasermicroscopie waar de resolutie 8-10x hoger ligt dan de voorgaande
microscopen. Er zijn wel veel voorwaarden zoals: een stabiele tafel, goede camera, sterke PC, …
Het benaderd de resolutie vaan een EM, maar is zelf een lichtmicroscoop (fluorescent). Het
toepassingsgebied van deze microscoop is de structurele biologie.
3
, Correlatieve microscopie
2 verschillende opnames van eenzelfde preparaat kunne naast elkaar worden gezet. Ze worden
gecombineerd zodat de complementaire informatie gedeeld wordt. Zo kan men bv een fluorescent
beeld combineren met een scanning elektronen beeld.
Elektronenmicroscopen
Transmittie-elektronenmicroscoop (TEM)
Oplossend vermogen = 0,1 nm. Lens = koperdraad rond een weekijzerkern. De bron van elektronen
(kathode) is meestal wolfraamdraad, dit is in vacuüm zodat de e- vrij kunnen bewegen. Door een
potentiaalverschil tussen anode en kathode worden de e- naar de anode versneld. In de anode is een
gat waar 5 elektromagnetische lenzen aanwezig zijn.
De donkere beelden zijn de plaatsen waar veel elektronen aanwezig zijn.
Scanning-elektronenmicroscoop (SEM)
Deze microscoop scant alle delen 1 voor 1 om zo een duidelijk beeld te kunnen krijgen. Het gescande
deel wordt via een versterker in grijswaarden omgezet. Dit leidt tot het maanlandschap effect en een
3D monochroom beeld. Om biologische structuren zichtbaar te maken wordt het preparaat in de 100%
alcoholfase ingevroren, gebroken en bekeken.
Scanning-probe microscopen
Microscoop dat onder water met levende cellen kan werken. Er wordt gemeten aan de hand van een
naald. Die naald beweegt en de kracht wordt gemeten vandaar de naam (Atomic Force Microscoop).
De kracht die de naald ondervindt wordt per pixel op een monitor weergegeven (in grijswaarden). Zo
vormt er een 3D monochroom beeld.
De interpretatie van microscopische beelden
Wanneer je een preparaat bekijkt ben je niet meteen zeker of dit overeenstemt met de werkelijk. Het
is ervoor namelijk verschillende stappen ondergaan waar artefacten kunnen gevormd zijn. Je kan wel
nagaan of het beeld dat je ziet reëel is door het te vergelijken. Dit kan je door het zelfde weefsel met
een andere techniek te bekijken. Als je hetzelfde waarneemt kan je besluiten dat het beeld
waarschijnlijk reëel is. De manier waarop je weefsel is doorgesneden is ook van groot belang.
4
Hoofdstuk 1: Waarnemingsmethoden .................................................................................................... 2
Hoofdstuk 2: Epitheel .............................................................................................................................. 7
Hoofdstuk 3: Bindweefsel ..................................................................................................................... 14
Hoofdstuk 4: Vetweefsel ....................................................................................................................... 21
Hoofdstuk 5: Kraakbeen ........................................................................................................................ 23
Hoofdstuk 6: Bot.................................................................................................................................... 26
Hoofdstuk 7: Bloed en Hemopoëse....................................................................................................... 33
Hoofdstuk 8: Spierweefsel .................................................................................................................... 48
Hoofdstuk 9: Zenuwweefsel .................................................................................................................. 53
Hoofdstuk 10: Zintuigen ........................................................................................................................ 64
Hoofdstuk 11: Huid................................................................................................................................ 76
Hoofdstuk 12: Signaaltransductie ......................................................................................................... 81
1
,Hoofdstuk 1: Waarnemingsmethoden
Inleiding
Weefsel = cellen + intercellulaire vloeistof + intercellulaire matrix.
Intercellulaire matrix = collageen en andere eiwitten en is een plaats voor interactie tussen cellen.
Weefselvoorbereiding
Een weefsel kan bijna nooit meteen onder een microscoop worden gelegd. Men gaat het dus eerst
moeten voorbereiden.
1. Het weefsel wordt gefixeerd en ingebed voordat het gesneden kan worden
2. De coupes zijn meestal niet fel gekleurd en zo moeilijk te bestuderen, vandaar dat men die
coupes gaat kleuren.
3. Tijdens de voorbereiding kunnen artefacten optreden.
Fixatie
De fixatie stopt het metabolisme van de cel. Men gaat chemicaliën gebruiken, deze zorgen ervoor dat
crosslinken denatureren en onwerkzaam maken van de enzymen, structurele proteïnen en
fosfolipiden niet meer gebeuren.
Cellen en weefsel moeten zo vers mogelijk gefixeerd worden. Dit kan door bevriezing, want cellen
bevatten veel water.
1. Fixatie bij lichtmicroscopie: Formaldehyde
2. Fixatie bij elektronenmicroscopie: glutaraldehyde / osmiumtetroxide
Fixatie elektronenmicroscopie: men gebruikt vaak een dubbele fixatie. Eerst gebruikt men
glutaaraldehyde, dit voorkomt volumeveranderingen is de cel. Daarna gaat men gebruikt maken van
osmiumtetroxide dat instaat voor het fixeren en crosslinken van onverzadigde banden in vetzuren.
Immersie weefsel wordt ondergedompeld in de vloeistoffen
Perfusie via de bloedvaten van het orgaan (betere methode)
Inbedding
Deze stap gebeurt om het weefsel goed te kunnen snijden.
Lichtmicroscopisch
1. Dehydratie weefsel in vloeistof met een alcohol percentage van 30-100%
2. Impregnatie In vloeibare parafine van 60°C, die stolt, er kunnen coupes worden gesneden.
3. Snijden coupes van 5 micrometer, door een stalen mes (microtoom)
4. Volgende stap gestrekt, op objectglaasje, gedeparaffineerd, gekleurd en dekglaasje
Elektronenmicroscoop
1. Dehydratie weefsel in vloeistof met een alcohol percentage van 30-100%
2. Inbedding epoxyharsen (harder, zodat dunnere coupes gesneden kunnen worden)
3. Snijden 50–100 nm door middel van een ultramicrotoom (glazen of diamanten mes)
4. Contrasteren men legt een druppel met Pd of uranylionen op de coupe
2
,Kleuring
Lichtmicroscoop: haematoxyline (basisch – basofiele nucleïnezuren DNA en RNA)
Eosine (Zuur – acidofiele eiwitten)
Insluiten in hars en afdekken met dekglas
Elektronenmicroscoop: contrasteren met Uranylacetaat of loodnitraat.
Lichtmicroscopen
Oplossend vermogen = resolutie
Het oplossend vermogen is de kleinste afstand waar 2 punten afzonderlijk waar worden genomen.
Een belangrijke specificatie van een object is de numerieke apparatuur.
De numerieke apparatuur bij een Lichtmicroscoop = 0,25 𝜇m (kleiner wordt niet waargenomen). Dit
zorgt ervoor dat organellen enkel zichtbaar zijn in een goede coupe.
De specificaties van een objectief is op de zijkant te zien: de vergroting, NA, tubuslengte en de
correlatie voor de dekglasdikte.
Fasecontrastmicroscoop
Dit is een techniek/microscoop waarbij ongekleurde preparaten worden bekeken. Er wordt een
zichtbaar beeld gevormd door faseveranderingen die ontstaan door kleine brekingsverschillen. Dit
zorgt voor variaties van licht en donker.
Interferentiecontrast
Kan ook toegepast worden bij ongekleurde preparaten. Hier wordt gebruik gemaakt van de
fasevertragingen die optreden wanneer het licht door get preparaat valt. Dit zorgt voor een
reliëfvormen en zo zijn andere structuren hier duidelijker aangetoond.
Polarisatiemicroscoop
Hier gaat men anisotrope structuren bekijken (spierfibrillen, collagene vezels, lensvezels,…). Deze
hebben het vermogen op licht te polariseren. Men gaat dus gebruik maken van 2 polarisatiefilters. De
eerste onder de condensator en de 2e tussen het objectief en de analysator.
Fluorecentiemicroscoop
Cellen of weefsel kunnen fluorescent gemaakt worden, maar ook als van nature fluorescent zijn
(Vitamine K). Door deze techniek is het mogelijk om fysiologische en biochemische processen te
bestuderen. Deze microscoop heeft een digitale camera zodat er geen licht verloren gaat en er een
duidelijker beeld gevormd kan worden.
Confocale laser-scanning microscoop CLSM
Alle fluorescente delen in een preparaat zullen zichtbaar zijn = kan wazig worden. Deze microscoop
gaat het preparaat lijn per lijn lezen. Het laat dan ook enkel het licht door waarop het gefocust is. De
plaats waar het licht doorkomt is de pinhole. De hoeveelheid licht dat de pinhole passeert wordt
gemeten door een fotomultiplierbuis. Dit wordt gedigitaliseerd en in een grafiek weergegeven. De
resolutie hier is 18 𝜇m. Door de digitale opvolging wordt een 3D beeld gevormd op de computer.
Superresolutiemicroscoop
Dit is een vorm van lasermicroscopie waar de resolutie 8-10x hoger ligt dan de voorgaande
microscopen. Er zijn wel veel voorwaarden zoals: een stabiele tafel, goede camera, sterke PC, …
Het benaderd de resolutie vaan een EM, maar is zelf een lichtmicroscoop (fluorescent). Het
toepassingsgebied van deze microscoop is de structurele biologie.
3
, Correlatieve microscopie
2 verschillende opnames van eenzelfde preparaat kunne naast elkaar worden gezet. Ze worden
gecombineerd zodat de complementaire informatie gedeeld wordt. Zo kan men bv een fluorescent
beeld combineren met een scanning elektronen beeld.
Elektronenmicroscopen
Transmittie-elektronenmicroscoop (TEM)
Oplossend vermogen = 0,1 nm. Lens = koperdraad rond een weekijzerkern. De bron van elektronen
(kathode) is meestal wolfraamdraad, dit is in vacuüm zodat de e- vrij kunnen bewegen. Door een
potentiaalverschil tussen anode en kathode worden de e- naar de anode versneld. In de anode is een
gat waar 5 elektromagnetische lenzen aanwezig zijn.
De donkere beelden zijn de plaatsen waar veel elektronen aanwezig zijn.
Scanning-elektronenmicroscoop (SEM)
Deze microscoop scant alle delen 1 voor 1 om zo een duidelijk beeld te kunnen krijgen. Het gescande
deel wordt via een versterker in grijswaarden omgezet. Dit leidt tot het maanlandschap effect en een
3D monochroom beeld. Om biologische structuren zichtbaar te maken wordt het preparaat in de 100%
alcoholfase ingevroren, gebroken en bekeken.
Scanning-probe microscopen
Microscoop dat onder water met levende cellen kan werken. Er wordt gemeten aan de hand van een
naald. Die naald beweegt en de kracht wordt gemeten vandaar de naam (Atomic Force Microscoop).
De kracht die de naald ondervindt wordt per pixel op een monitor weergegeven (in grijswaarden). Zo
vormt er een 3D monochroom beeld.
De interpretatie van microscopische beelden
Wanneer je een preparaat bekijkt ben je niet meteen zeker of dit overeenstemt met de werkelijk. Het
is ervoor namelijk verschillende stappen ondergaan waar artefacten kunnen gevormd zijn. Je kan wel
nagaan of het beeld dat je ziet reëel is door het te vergelijken. Dit kan je door het zelfde weefsel met
een andere techniek te bekijken. Als je hetzelfde waarneemt kan je besluiten dat het beeld
waarschijnlijk reëel is. De manier waarop je weefsel is doorgesneden is ook van groot belang.
4
