Scheidingstechnieken en eiwitzuivering
Hoofdstuk 1: inleiding
1. Scheidingstechnieken
= het scheiden van verschillende componenten op basis van het
verschil in bepaalde stofeigenschappen (bv. Deeltjesgrootte,
kookpunt,….)
Filtratie: verschil in deeltjesgrootte
Extractie: verschil in oplosbaarheid
Destillatie: verschil in kooktemperatuur
Indampen: verschil in fase, vaste stof in een vloeistof verkrijgen
door de vloeistof te laten verdampen, verschil in kookpunt
Centrifugeren/decanteren: verschil in gewicht/massadichtheid,
door het snel laten draaien van het staal worden de zwaardere
deeltjes naar de buitenkant geduwd
Elektroforese: verschil in ionlading; kan met behulp van SDS
Chromatografie: met behulp van een stationaire en mobiele fase
maakt gebruik van verschil in oplosbaarheid, grootte, polariteit,
adsorptie en vluchtigheid
2. Chromatografie
Hierbij maak je gebruik van een stationaire en een mobiele fase
Stationaire fase (SF): stof die stilstaat = vast of vloeistof
Mobiele fase (MS): stof die beweegt = gas of vloeibaar
Je brengt een druppel van het staal aan op de SF en laat MB erdoor
lopen, afh van de affiniteit tussen het staal en de SF en MS krijg je
een resultaat
Hiermee kan je bepalen of een stof al dan niet zuiver is
Zuiver = 1 bol op de SF
Onzuiver = meerdere bollen op de SF
2.1 Soorten chromatografie
Analytische chromatografie: weinig hoeveelheid staal, om
samenstelling te achterhalen
Preparatieve chromatografie: grote hoeveelheid staal, om de
individuele componenten in het mengsel in zuivere toestand te
isoleren
2.2 Dunnelaagchromatografie
Wordt gedaan op een papiertje die in een beker met de MS wordt
gebracht
Hoe verder het stipje omhoog is hoe minder affiniteit het heeft
tov de SF en MS
De SF bestaat uit een vaste fase zoals silicagel, of een vloeibare
fase zoals cellulosepoeder in water
, De MF bestaat uit een organisch solvent of mengsel van
organische solventen
Rf-waarde = de afstand van de stip/de afstand van de MS, moet
tussen 0 en 1
Vraag:
De stof met de grootste Rf-waarde heeft de meeste affiniteit
met de SF?
Fout, want deze heeft de verste afstand afgelegd
2.3 Kolomchromatografie
Hierbij laat je da MF lopen door de SF, aan de hand van de
opgevangen druppeltjes kan je bepalen waar de MF zich bevindt
Hier kan je niet midden in het experiment stoppen om te
kijken waar de MF is bij dunnelaagchromatografie wel
Elutie: het lopen van de mobiele fase door de stationaire fase
Eluens of eluent: dit is de mobiele fase die gebruikt wordt
Eluaat: de stof die op het einde opgevangen wordt
2.3.1 Chromatogram
= verband tussen detectorsignaal en de tijd die verloopt
vanaf de start
De oppervlakte van de piek = de hoeveelheid stof
Parameters die uit chromatogram te halen zijn:
1. Dode tijd: tm of t0 = de tijd die de component nodig
heeft om door de kolom te stromen
2. Retentietijd: tr = tijd tussen begin van de scheiding
en de maximumpiek
3. Breedte van de piek gemeten aan de basis
4. Retentievolume: Vr = tr * u
5. Oppervlakte onder de piek: dit geeft de
hoeveelheid stof weer
6. Resolutie: Rs = mate waarin 2 stoffen gescheiden
worden gedurende het experiment
2.4 Indeling chromatografie afh van de aard van de MF en SF
MF = vloeistof =>
vloeistofchromatografie/liquidchromatografphy (LC)
SF = vloeistof geadsorbeerd of gebonden aan een vast
oppervlak => vloeistof-vloeistofchromatografie (LLC)
SF = vast => vloeistof-vastchromatografie (LSC)
SF = ion-uitwisselingshars =>
ionenuitwisselingschromatografie (IEC)
SF = ligand gebonden op vast oppervlak =>
affiniteitschromatografie
, SF = vloeistof in poriën vast polymeer => size exclusion
chromatography (SEC)
MF = gas => gaschromatografie (GC)
SF = vloeistof gadsorbeerd of gebonden aan een vast
oppervlak => gas-vloeistofchromatografie (GLC)
SF = vast => gast-vast chromatografie (GSC)
Hoofdstuk 2: uitwisselingsprincipes
1. Adsorptiechromatografie
= een scheiding waarbij verbindingen uit de mobiele fase
adsorberen aan het actief oppervlak van de stationaire fase
= vaste stof en vloeistof
Adsorptie: het vermogen van een stof om aan zijn opp enkele
moleculen te binden
Gebaseerd op interactie tussen analyt en SF
1.1 Voorwaarden bij deze techniek
Moleculen niet te polair
Moleculen niet ionogeen; je wil dat ze terug loskomen
Lage moleculemassa
1.2 Adsorbens
Silicagel = groot aantal actieve plaatsen voor interactie met
polaire functionele groepen; de silanolgroepen maken het
zuur
Silanol kan met een organochloorsilaanverbinding reageren =
gebonden-fase pakking
Aluminiumoxide = basisch
Actieve kool en polystyreen = apolair, zorgen voor
londonkrachten
1.3 Silanolgroepen
Silicagel = opgebouwd uit silanolgroep die met elkaar verbonden
zijn
Elke Si kan met 4 andere atomen binden
Aan het oppervalk zijn er vrije silanolgroepen die instaat als
protondonor => de groepen gedragen zich dus zuur
Activiteit van silicagel is afh van de hoeveelheid water die
toegevoegd wordt, want H20 interageert met het opp van de
silicagel
Silanolgroepen kunnen binden met organische verbindingen =
gebonden-fase pakking of bonded-phases
, Silicagel dient hier als drager waarop een SF gebonden wordt =
verandering van polariteit
Zie pagina 13 voor reactie: meestal met een molecule die een Cl-
bevat
2. Verdelingschromatografie/partitiechromatografie
= verdeling van de stoffen tussen de niet mengbare SF en MF,
gebaseerd op verschil in oplosbaarheid in de SF en MF
= vloeistof en vloeistof
De polariteit van SF, MF en de componenten is heel belangrijk
2.1 De verschillende fases
SF = een dunne film op een vaste drager
MF = vloeistof (LLC) of gas (GLC)
De fases moeten onmengbaar zijn
2.2 Vergelijking met extractie
Scheidingsmethode wordt vergeleken met extractie maar hier
blijft de stationaire fase op zijn plaats
De mobiele fase wordt er over gegoten
Stationaire fase: heeft een polariteit die overeenkomt met die
van de analyten
Mobiele fase: heeft een andere polariteit dan die van de
analyten
Verdelingscoëfficiënt Kv = stof extractievl/stof in
oorspronkelijke vl
2.3 Verschillende soorten LLC
Normal phase LLC: stationaire fase meer polair dan de mobiele
fase => elutievolgorde van apolair (snelst) naar polair (traagst)
bv. -CN,-NH2,diolen,silicagel
Reversed phase LLC: stationaire fase minder polair dan de
mobiele fase => elutievolgorde van apolair (snelst) naar polair
(traagst) (meest gebruikt = C18 zie pagina 17)
Bv. C8,C18,fenyl
2.3.1 C18 kolom
Wordt gemaakt uit silicagel; door het binden van groepen
Sterische hinder zorgt ervoor dat er niet overal gebonden
kan worden => door endcapping met kleiner moleculen
raken toch alle plaatsen bezet
Hoofdstuk 1: inleiding
1. Scheidingstechnieken
= het scheiden van verschillende componenten op basis van het
verschil in bepaalde stofeigenschappen (bv. Deeltjesgrootte,
kookpunt,….)
Filtratie: verschil in deeltjesgrootte
Extractie: verschil in oplosbaarheid
Destillatie: verschil in kooktemperatuur
Indampen: verschil in fase, vaste stof in een vloeistof verkrijgen
door de vloeistof te laten verdampen, verschil in kookpunt
Centrifugeren/decanteren: verschil in gewicht/massadichtheid,
door het snel laten draaien van het staal worden de zwaardere
deeltjes naar de buitenkant geduwd
Elektroforese: verschil in ionlading; kan met behulp van SDS
Chromatografie: met behulp van een stationaire en mobiele fase
maakt gebruik van verschil in oplosbaarheid, grootte, polariteit,
adsorptie en vluchtigheid
2. Chromatografie
Hierbij maak je gebruik van een stationaire en een mobiele fase
Stationaire fase (SF): stof die stilstaat = vast of vloeistof
Mobiele fase (MS): stof die beweegt = gas of vloeibaar
Je brengt een druppel van het staal aan op de SF en laat MB erdoor
lopen, afh van de affiniteit tussen het staal en de SF en MS krijg je
een resultaat
Hiermee kan je bepalen of een stof al dan niet zuiver is
Zuiver = 1 bol op de SF
Onzuiver = meerdere bollen op de SF
2.1 Soorten chromatografie
Analytische chromatografie: weinig hoeveelheid staal, om
samenstelling te achterhalen
Preparatieve chromatografie: grote hoeveelheid staal, om de
individuele componenten in het mengsel in zuivere toestand te
isoleren
2.2 Dunnelaagchromatografie
Wordt gedaan op een papiertje die in een beker met de MS wordt
gebracht
Hoe verder het stipje omhoog is hoe minder affiniteit het heeft
tov de SF en MS
De SF bestaat uit een vaste fase zoals silicagel, of een vloeibare
fase zoals cellulosepoeder in water
, De MF bestaat uit een organisch solvent of mengsel van
organische solventen
Rf-waarde = de afstand van de stip/de afstand van de MS, moet
tussen 0 en 1
Vraag:
De stof met de grootste Rf-waarde heeft de meeste affiniteit
met de SF?
Fout, want deze heeft de verste afstand afgelegd
2.3 Kolomchromatografie
Hierbij laat je da MF lopen door de SF, aan de hand van de
opgevangen druppeltjes kan je bepalen waar de MF zich bevindt
Hier kan je niet midden in het experiment stoppen om te
kijken waar de MF is bij dunnelaagchromatografie wel
Elutie: het lopen van de mobiele fase door de stationaire fase
Eluens of eluent: dit is de mobiele fase die gebruikt wordt
Eluaat: de stof die op het einde opgevangen wordt
2.3.1 Chromatogram
= verband tussen detectorsignaal en de tijd die verloopt
vanaf de start
De oppervlakte van de piek = de hoeveelheid stof
Parameters die uit chromatogram te halen zijn:
1. Dode tijd: tm of t0 = de tijd die de component nodig
heeft om door de kolom te stromen
2. Retentietijd: tr = tijd tussen begin van de scheiding
en de maximumpiek
3. Breedte van de piek gemeten aan de basis
4. Retentievolume: Vr = tr * u
5. Oppervlakte onder de piek: dit geeft de
hoeveelheid stof weer
6. Resolutie: Rs = mate waarin 2 stoffen gescheiden
worden gedurende het experiment
2.4 Indeling chromatografie afh van de aard van de MF en SF
MF = vloeistof =>
vloeistofchromatografie/liquidchromatografphy (LC)
SF = vloeistof geadsorbeerd of gebonden aan een vast
oppervlak => vloeistof-vloeistofchromatografie (LLC)
SF = vast => vloeistof-vastchromatografie (LSC)
SF = ion-uitwisselingshars =>
ionenuitwisselingschromatografie (IEC)
SF = ligand gebonden op vast oppervlak =>
affiniteitschromatografie
, SF = vloeistof in poriën vast polymeer => size exclusion
chromatography (SEC)
MF = gas => gaschromatografie (GC)
SF = vloeistof gadsorbeerd of gebonden aan een vast
oppervlak => gas-vloeistofchromatografie (GLC)
SF = vast => gast-vast chromatografie (GSC)
Hoofdstuk 2: uitwisselingsprincipes
1. Adsorptiechromatografie
= een scheiding waarbij verbindingen uit de mobiele fase
adsorberen aan het actief oppervlak van de stationaire fase
= vaste stof en vloeistof
Adsorptie: het vermogen van een stof om aan zijn opp enkele
moleculen te binden
Gebaseerd op interactie tussen analyt en SF
1.1 Voorwaarden bij deze techniek
Moleculen niet te polair
Moleculen niet ionogeen; je wil dat ze terug loskomen
Lage moleculemassa
1.2 Adsorbens
Silicagel = groot aantal actieve plaatsen voor interactie met
polaire functionele groepen; de silanolgroepen maken het
zuur
Silanol kan met een organochloorsilaanverbinding reageren =
gebonden-fase pakking
Aluminiumoxide = basisch
Actieve kool en polystyreen = apolair, zorgen voor
londonkrachten
1.3 Silanolgroepen
Silicagel = opgebouwd uit silanolgroep die met elkaar verbonden
zijn
Elke Si kan met 4 andere atomen binden
Aan het oppervalk zijn er vrije silanolgroepen die instaat als
protondonor => de groepen gedragen zich dus zuur
Activiteit van silicagel is afh van de hoeveelheid water die
toegevoegd wordt, want H20 interageert met het opp van de
silicagel
Silanolgroepen kunnen binden met organische verbindingen =
gebonden-fase pakking of bonded-phases
, Silicagel dient hier als drager waarop een SF gebonden wordt =
verandering van polariteit
Zie pagina 13 voor reactie: meestal met een molecule die een Cl-
bevat
2. Verdelingschromatografie/partitiechromatografie
= verdeling van de stoffen tussen de niet mengbare SF en MF,
gebaseerd op verschil in oplosbaarheid in de SF en MF
= vloeistof en vloeistof
De polariteit van SF, MF en de componenten is heel belangrijk
2.1 De verschillende fases
SF = een dunne film op een vaste drager
MF = vloeistof (LLC) of gas (GLC)
De fases moeten onmengbaar zijn
2.2 Vergelijking met extractie
Scheidingsmethode wordt vergeleken met extractie maar hier
blijft de stationaire fase op zijn plaats
De mobiele fase wordt er over gegoten
Stationaire fase: heeft een polariteit die overeenkomt met die
van de analyten
Mobiele fase: heeft een andere polariteit dan die van de
analyten
Verdelingscoëfficiënt Kv = stof extractievl/stof in
oorspronkelijke vl
2.3 Verschillende soorten LLC
Normal phase LLC: stationaire fase meer polair dan de mobiele
fase => elutievolgorde van apolair (snelst) naar polair (traagst)
bv. -CN,-NH2,diolen,silicagel
Reversed phase LLC: stationaire fase minder polair dan de
mobiele fase => elutievolgorde van apolair (snelst) naar polair
(traagst) (meest gebruikt = C18 zie pagina 17)
Bv. C8,C18,fenyl
2.3.1 C18 kolom
Wordt gemaakt uit silicagel; door het binden van groepen
Sterische hinder zorgt ervoor dat er niet overal gebonden
kan worden => door endcapping met kleiner moleculen
raken toch alle plaatsen bezet
