Samenvatting farmaceutische biotechnologie : detectie en zuivering van biotechnologisch aangemaakte eiwitten

DEEL 2 : DETECTIE EN ZUIVERING VAN
BIOTECHNOLOGISCH AANGEMAAKTE EIWITTEN
1. Detectie van recombinante eiwitten
1.1. Detectie van eiwitten in oplossing
 Verscheidene colorimetrische en fluorimetrische methoden beschikbaar
(bv methoden van Lowry, Bradford, BCA (Pierce) en NanoOrange (Molecular Probes))

 Principe:
- Eiwitten binden op een min of meer aspecifieke manier aan een kleurstof of een
fluorescerende stof
- Bij binding veranderen de spectroscopische eigenschappen van deze stoffen
- Concentratie wordt bepaald aan de hand van een ijkingscurve (meestal goedkoop
eiwit zoals BSA [bovine serum albumine]).


Coomassie (Bradford) eiwitassay (heel veel toegepast)
 Beschreven door Marion Bradford in 1976
 Eiwitten (>3 kDa) binden op Coommassie G-250 in een
zure omgeving
→ spectrale shift van rood/bruin naar blauw
 Aminozuren of peptiden (moeten zekere grootte hebben)
binden niet op Coomassie G-250

 Voordelen
- Snel en eenvoudig
- Meting bij kamertemperatuur
- Compatibel met meeste zouten, solventen en buffers
 Nadelen :
- De assay produceert een niet-lineaire standaardcurve
- Binding van Coomassie G-250 met eiwit afhankelijk van
bepaalde basische aminozuren (vooral arginine) en
hydrofobe aminozuren
→ Aminozuursamenstelling van eiwit bepaalt concentratie-
absorptie curve
→ Geschikte standaard gebruiken (ong zelfde AZ als je eiwit)
- Niet compatibel met detergenten (precipitatie van Coomassie G-250)
- Sommige eiwitten weinig oplosbaar in zure Coomassie G250 reagens
- Methode niet erg gevoelig (Range: 100-1500 µg/ml)

Bicinchoninic acid (BCA) eiwitassay (2e klassieker die men vaak toepast)
 Beschreven door Paul K Smith in 1985
 Principe:
- Reductie van Cu2+ naar Cu1+ door eiwit in een alkalisch milieu
- Interactie van Cu1+ met 2 BCA moleculen tot een purper-gekleurd BCA-Cu 1+ complex
- Meting bij bepaalde golflengte

,  Voordelen BCA assay
- Compatibel met meeste detergenten (tot 5%)
- Beter lineair bereik ivm Bradford
- Eiwit-tot-eiwit variatie vs kleurvorming relatief laag
- Hogere gevoeligheid ivm Bradford Range: 20-2000 µg/ml
 Nadelen BCA assay
- Substanties die koper reduceren: produceren kleur in BCA assay
- Reagentia die koper cheleren (wegvangen) : inhiberen kleurreactie
- Sommige vrije aminozuren produceren kleur in BCA assay
- Reactie niet bij kamertemperatuur (37°C, 30 min).
Incubaties bij temperaturen >37°C (bv. 60°C, 30 min) geven hogere gevoeligheid (5-
250 µg/ml)

In sommige eiwitbepalingen : modificatie van een specifieke functionele groep van de eiwitten
(meestal primaire aminogroepen van de lysine zijketens en de N-terminus)
Voorbeeld : fluorescamine methode
 Het adduct is fluorescerend, het reagens niet
 De overmaat aan reagens hydrolyseert snel in water tot niet fluorescerende
eindproducten
 Enkel toepasbaar in buffers die geen primaire amines bevatten
 Methode ook gebruikt om het aantal aminogroepen te bepalen in oplossing




1.2. SDS polyacrylamide gelelektroforese
 Doel : eiwitten scheiden volgens hun grootte door een elektrische spanning aan te leggen
tussen de uiteinden van de gel
 2 mogelijkheden
- Scheiding onder natieve condities: netto lading en de massa van het natieve eiwit
bepaalt op welke plaats het zal migreren
- Scheiding onder denaturerende condities: SDS polyacrylamide gelelectroforese
 Toepassingen
- Beoordeling van de zuiverheid van een eiwitpreparaat
- Bepaling van het molecuulgewicht van een eiwit
- Nagaan van eiwitdegradatie

SDS polyacrylamide gelelektroforse : eiwitten worden opgenomen in een buffer met
volgende componenten :
 Een reducerend agens (β-mercaptoethanol of dithiothreitol)
- Reduceert S-S verbindingen
 Een denaturerend agens (SDS = sodium dodecyl sulphate)
- SDS = anionisch detergent
- Bindt met eiwitten in een stoechiometrische verhouding van 1,4 g SDS/g eiwit
→ Eiwitten worden negatief geladen staafjes
- Negatieve lading afkomstig van sulfaatgroep van SDS
- In een SDS-gel zullen alle eiwitten dus naar de positieve elektrode migreren