Aantekeningen van alle hoorcolleges
biotechnologie
Toegepaste Biologie
Moleculaire Biotechnologie
Jaar 2, Blok 2
16-01-2024
Jacoline Boer
,Inhoud
1. Basis DNA-technieken .................................................................................................................................... 3
1.1 DNA-technieken ............................................................................................................................................ 4
1.2 Extraheren en synthetiseren ........................................................................................................................ 4
1.3 Knippen door middel van restrictie-enzymen .............................................................................................. 4
1.4 DNA plakken met ligatie en hybridisatie....................................................................................................... 5
1.5 DNA kopiëren: PCR en klonen....................................................................................................................... 5
1.6 DNA zichtbaar maken: elektroforese en kleuring ......................................................................................... 6
1.7 RNA isoleren en verwerken .......................................................................................................................... 6
1.8 Conclusie (gekopieerd uit PowerPoint) ........................................................................................................ 7
2. DNA-merkers en DNA-technieken .................................................................................................................. 8
2.1 Inleiding ........................................................................................................................................................ 8
2.2 Onbekende sequentie ................................................................................................................................... 8
2.2.1 Sanger sequencing ................................................................................................................................. 8
2.2.2 Next generation sequencing.................................................................................................................. 9
2.2.3 Beyond next generation sequencing ................................................................................................... 10
2.3 Bekende sequentie ..................................................................................................................................... 10
2.3.1 PCR-RFLP.............................................................................................................................................. 10
2.3.2 Allel specifieke PCR .............................................................................................................................. 11
PCR met microsatellieten ................................................................................................................................. 11
2.3.3 Microarray ........................................................................................................................................... 12
2.3.4 RNA Sequencing analysis ..................................................................................................................... 12
2.3.5 qPCR .................................................................................................................................................... 13
2.3.6 ddPCR .................................................................................................................................................. 14
3. Regulatie van de genexpressie .......................................................................................................................... 15
3.1 Inleiding ...................................................................................................................................................... 15
3.2 Prokaryote genregulatie ............................................................................................................................. 15
3.2.1 Regularor eiwitten en operons ............................................................................................................ 15
3.2.2 Het Lac-operon .................................................................................................................................... 16
3.2.3 TRP ....................................................................................................................................................... 17
3.3 Eukaryotische genregulatie ................................................................................................................. 18
3.3.1 Eukaryotische chromatine modificaties .............................................................................................. 18
3.3.2 Eukaryotische transcription control .................................................................................................... 19
3.3.3 Post-transscriptionele regulatie .......................................................................................................... 20
4. Regulatie van de genexpressie .......................................................................................................................... 21
4.1 Differentiatie............................................................................................................................................... 21
4.2 Inductie ....................................................................................................................................................... 21
4.3 Determinatie ............................................................................................................................................... 21
2
, 4.5 Het ontstaan van een lichaamsbouwplan .................................................................................................. 21
4.6 Horizontale gen overdracht bij prokaryoten .............................................................................................. 22
4.6.1 Transformatie ...................................................................................................................................... 22
4.6.2 Transductie .......................................................................................................................................... 23
4.6.3 Conjugatie ........................................................................................................................................... 24
5. Genetische modificatie ..................................................................................................................................... 26
5.1 DNA-Cloning en genetische modificatie ..................................................................................................... 26
5.2 CRISPR-Cas9 ................................................................................................................................................ 28
3
, 1. Basis DNA-technieken
1.1 DNA-technieken
Genetische merkers zijn stukjes DNA, RNA of eiwit. Het zegt iets over de aanwezigheid van
een bepaald gen. Een stukje DNA kan bijvoorbeeld kenmerkend zijn voor een bepaald gen,
dus als je deze merker kan aantonen, kun je vaststellen dat het gen aanwezig is. Je kunt de
variatie op 3 niveaus zichtbaar maken:
- DNA: genetische variatie
- (m)RNA: verschillen in de genexpressie
- Eiwit: verschillen in de genexpressie en/of genetische variatie
Alle DNA-technieken zijn gebaseerd op:
- DNA-extractie
- DNA-restrictie (knippen)
- DNA ligatie (plakken)
- DNA-hybridisatie (twee complementaire enkelstrengs moleculen aan elkaar binden
- DNA-replicatie/amplificatie (kopiëren)
- Meten/visualiseren
DNA vrijmaken uit cellen: DNA-extractie
DNA chemisch maken: DNA-synthese
1.2 Extraheren en synthetiseren
DNA extraheren betekent het uit de cel halen. Hierbij moeten celwanden, -membranen en
eiwitten worden afgebroken, terwijl het DNA heel moet blijven. Per cel verschilt het hoe je het
DNA er het makkelijkst uit kan halen. Er zijn drie DNA-bronnen mogelijk in een eukaryote cel:
‘normaal DNA’, mitochondriaal DNA en chloroplast-DNA.
Extraheren:
1. Het openbreken van de cellen: lysis. Dit kan bijvoorbeeld door het weefsel fijn te
malen, en/of door een soort zeep toe te voegen waardoor het celmembraan uit elkaar
valt.
2. Eiwitten verwijderen (dit is niet altijd nodig): eiwitten worden meestal afgebroken
door een protease enzym toe te voegen dat eiwitten afbreekt.
3. DNA uit de oplossing halen: door een ijskoude alcohol toe te voegen, slaat het DNA
uit de oplossing neer. DNA is namelijk minder goed oplosbaar in een alcohol dan in
water. Het neergeslagen DNA kan vervolgens uit de oplossing worden gehaald,
bijvoorbeeld door te centrifugeren of door het met een pipet op te zuigen.
1.3 Knippen door middel van restrictie-enzymen
Het knippen van DNA (restrictie) gaat door restrictie-enzymen. Ze knippen een specifieke
DNA-sequentie van een dubbele helix. Ze knippen dus altijd tussen twee ‘letters’.
Verschillende restrictie-enzymen knippen verschillende sequenties, zodat je kunt kiezen waar
je het DNA geknipt wil hebben.
Restrictie-enzymen hebben natuurlijke functies in de cel, bijvoorbeeld het vernietigen van
virus-DNA of het inbouwen van een opgenomen gen in een bacteriechromosoom. Ze zijn
4
, commercieel verkrijgbaar met meer dan 100 verschillende target sequenties. Ze worden
gebruikt om DNA-moleculen kleiner te maken. Dit kan
- Willekeurig: het maakt niet echt uit welk enzym je gebruikt maar je wilt kleinere
stukjes DNA
- Gericht: je kijkt goed welk enzym je gebruikt en je wilt precies tussen twee letters
knippen
Sommige restrictie-enzymen knippen het DNA recht doormidden (blunt), terwijl andere het
DNA diagonaal knippen en zorgen voor korte enkelstrengs uiteinden (sticky ends).
Voor het gebruik hiervan moet je vaak al een goed inzicht hebben in hoe het DNA er uit ziet,
anders is het lastig om precies te kunnen knippen.
1.4 DNA plakken met ligatie en hybridisatie
Ligatie is het plakken van suikerfosfaat ketens door een ligase-enzym. Dit kan handig zijn bij:
- Het inbouwen van conjugatieve plasmiden (dsDNA) in een bacterieel chromosoom
- Het inbouwen van ssDNA na transformatie voordat hybridisatie plaatsvindt
- Het inbouwen van dsDNA na transductie door een transducing particle (HC4)
DNA-hybridisatie is de vorming van complementaire basenparen door twee enkelstrengs
moleculen met elkaar te verbinden door waterstofbruggen. Bij DNA-replicatie verzorgt DNA-
polymerase de hybridisatie.
Hybridisatie: twee enkelstrengs ketens aan elkaar plakken met waterstofverbindingen. Ligatie:
twee stukken die dubbelstrengs zijn aan elkaar doen door fosfaatverbindingen
Oligonucleotiden:
- Primers: enkelstrengs, 18-25 nucleotiden
- Adapters: dubbelstrengs, 18-25 nucleotiden
- Probes: enkelstrengs, 100-1000 nucleotiden
1.5 DNA kopiëren: PCR en klonen
Zelf DNA kopiëren kan zowel in vitro als in vivo. In vivo kan het door PCR. In vivo door gene
cloning (HC2).
PCR staat voor Polymerase Chain Reaction. Er wordt geamplificeerd: heel veel gekopieerd.
Het is niet geschikt voor bijvoorbeeld hele chromosomen, maar wel voor stukken DNA van
100 tot 1500 nucleotiden. Voor de techniek is het handig om een video te bekijken (zie
opmerkingen bij slide 22 bij de PowerPoint HC1).
Je wilt de target-sequentie vermeerderen. Dit doe je door:
1. Het target DNA heel warm maken waardoor het gaat denatureren
2. Er worden twee primers neergezet (een forward en een reverse primer. Deze
verschillen van elkaar!). Het DNA koelt af en de primers kunnen gaan binden op de
begin- en eindstukken, maar de twee strengen moeten niet weer terug gaan binden,
dus ook weer niet te ver afkoelen.
3. Extensie: het DNA wordt verlengd en er komen nieuwe nucleotiden.
Pas bij de derde herhaling heb je je hele target sequentie en geen overige stukken.
5
biotechnologie
Toegepaste Biologie
Moleculaire Biotechnologie
Jaar 2, Blok 2
16-01-2024
Jacoline Boer
,Inhoud
1. Basis DNA-technieken .................................................................................................................................... 3
1.1 DNA-technieken ............................................................................................................................................ 4
1.2 Extraheren en synthetiseren ........................................................................................................................ 4
1.3 Knippen door middel van restrictie-enzymen .............................................................................................. 4
1.4 DNA plakken met ligatie en hybridisatie....................................................................................................... 5
1.5 DNA kopiëren: PCR en klonen....................................................................................................................... 5
1.6 DNA zichtbaar maken: elektroforese en kleuring ......................................................................................... 6
1.7 RNA isoleren en verwerken .......................................................................................................................... 6
1.8 Conclusie (gekopieerd uit PowerPoint) ........................................................................................................ 7
2. DNA-merkers en DNA-technieken .................................................................................................................. 8
2.1 Inleiding ........................................................................................................................................................ 8
2.2 Onbekende sequentie ................................................................................................................................... 8
2.2.1 Sanger sequencing ................................................................................................................................. 8
2.2.2 Next generation sequencing.................................................................................................................. 9
2.2.3 Beyond next generation sequencing ................................................................................................... 10
2.3 Bekende sequentie ..................................................................................................................................... 10
2.3.1 PCR-RFLP.............................................................................................................................................. 10
2.3.2 Allel specifieke PCR .............................................................................................................................. 11
PCR met microsatellieten ................................................................................................................................. 11
2.3.3 Microarray ........................................................................................................................................... 12
2.3.4 RNA Sequencing analysis ..................................................................................................................... 12
2.3.5 qPCR .................................................................................................................................................... 13
2.3.6 ddPCR .................................................................................................................................................. 14
3. Regulatie van de genexpressie .......................................................................................................................... 15
3.1 Inleiding ...................................................................................................................................................... 15
3.2 Prokaryote genregulatie ............................................................................................................................. 15
3.2.1 Regularor eiwitten en operons ............................................................................................................ 15
3.2.2 Het Lac-operon .................................................................................................................................... 16
3.2.3 TRP ....................................................................................................................................................... 17
3.3 Eukaryotische genregulatie ................................................................................................................. 18
3.3.1 Eukaryotische chromatine modificaties .............................................................................................. 18
3.3.2 Eukaryotische transcription control .................................................................................................... 19
3.3.3 Post-transscriptionele regulatie .......................................................................................................... 20
4. Regulatie van de genexpressie .......................................................................................................................... 21
4.1 Differentiatie............................................................................................................................................... 21
4.2 Inductie ....................................................................................................................................................... 21
4.3 Determinatie ............................................................................................................................................... 21
2
, 4.5 Het ontstaan van een lichaamsbouwplan .................................................................................................. 21
4.6 Horizontale gen overdracht bij prokaryoten .............................................................................................. 22
4.6.1 Transformatie ...................................................................................................................................... 22
4.6.2 Transductie .......................................................................................................................................... 23
4.6.3 Conjugatie ........................................................................................................................................... 24
5. Genetische modificatie ..................................................................................................................................... 26
5.1 DNA-Cloning en genetische modificatie ..................................................................................................... 26
5.2 CRISPR-Cas9 ................................................................................................................................................ 28
3
, 1. Basis DNA-technieken
1.1 DNA-technieken
Genetische merkers zijn stukjes DNA, RNA of eiwit. Het zegt iets over de aanwezigheid van
een bepaald gen. Een stukje DNA kan bijvoorbeeld kenmerkend zijn voor een bepaald gen,
dus als je deze merker kan aantonen, kun je vaststellen dat het gen aanwezig is. Je kunt de
variatie op 3 niveaus zichtbaar maken:
- DNA: genetische variatie
- (m)RNA: verschillen in de genexpressie
- Eiwit: verschillen in de genexpressie en/of genetische variatie
Alle DNA-technieken zijn gebaseerd op:
- DNA-extractie
- DNA-restrictie (knippen)
- DNA ligatie (plakken)
- DNA-hybridisatie (twee complementaire enkelstrengs moleculen aan elkaar binden
- DNA-replicatie/amplificatie (kopiëren)
- Meten/visualiseren
DNA vrijmaken uit cellen: DNA-extractie
DNA chemisch maken: DNA-synthese
1.2 Extraheren en synthetiseren
DNA extraheren betekent het uit de cel halen. Hierbij moeten celwanden, -membranen en
eiwitten worden afgebroken, terwijl het DNA heel moet blijven. Per cel verschilt het hoe je het
DNA er het makkelijkst uit kan halen. Er zijn drie DNA-bronnen mogelijk in een eukaryote cel:
‘normaal DNA’, mitochondriaal DNA en chloroplast-DNA.
Extraheren:
1. Het openbreken van de cellen: lysis. Dit kan bijvoorbeeld door het weefsel fijn te
malen, en/of door een soort zeep toe te voegen waardoor het celmembraan uit elkaar
valt.
2. Eiwitten verwijderen (dit is niet altijd nodig): eiwitten worden meestal afgebroken
door een protease enzym toe te voegen dat eiwitten afbreekt.
3. DNA uit de oplossing halen: door een ijskoude alcohol toe te voegen, slaat het DNA
uit de oplossing neer. DNA is namelijk minder goed oplosbaar in een alcohol dan in
water. Het neergeslagen DNA kan vervolgens uit de oplossing worden gehaald,
bijvoorbeeld door te centrifugeren of door het met een pipet op te zuigen.
1.3 Knippen door middel van restrictie-enzymen
Het knippen van DNA (restrictie) gaat door restrictie-enzymen. Ze knippen een specifieke
DNA-sequentie van een dubbele helix. Ze knippen dus altijd tussen twee ‘letters’.
Verschillende restrictie-enzymen knippen verschillende sequenties, zodat je kunt kiezen waar
je het DNA geknipt wil hebben.
Restrictie-enzymen hebben natuurlijke functies in de cel, bijvoorbeeld het vernietigen van
virus-DNA of het inbouwen van een opgenomen gen in een bacteriechromosoom. Ze zijn
4
, commercieel verkrijgbaar met meer dan 100 verschillende target sequenties. Ze worden
gebruikt om DNA-moleculen kleiner te maken. Dit kan
- Willekeurig: het maakt niet echt uit welk enzym je gebruikt maar je wilt kleinere
stukjes DNA
- Gericht: je kijkt goed welk enzym je gebruikt en je wilt precies tussen twee letters
knippen
Sommige restrictie-enzymen knippen het DNA recht doormidden (blunt), terwijl andere het
DNA diagonaal knippen en zorgen voor korte enkelstrengs uiteinden (sticky ends).
Voor het gebruik hiervan moet je vaak al een goed inzicht hebben in hoe het DNA er uit ziet,
anders is het lastig om precies te kunnen knippen.
1.4 DNA plakken met ligatie en hybridisatie
Ligatie is het plakken van suikerfosfaat ketens door een ligase-enzym. Dit kan handig zijn bij:
- Het inbouwen van conjugatieve plasmiden (dsDNA) in een bacterieel chromosoom
- Het inbouwen van ssDNA na transformatie voordat hybridisatie plaatsvindt
- Het inbouwen van dsDNA na transductie door een transducing particle (HC4)
DNA-hybridisatie is de vorming van complementaire basenparen door twee enkelstrengs
moleculen met elkaar te verbinden door waterstofbruggen. Bij DNA-replicatie verzorgt DNA-
polymerase de hybridisatie.
Hybridisatie: twee enkelstrengs ketens aan elkaar plakken met waterstofverbindingen. Ligatie:
twee stukken die dubbelstrengs zijn aan elkaar doen door fosfaatverbindingen
Oligonucleotiden:
- Primers: enkelstrengs, 18-25 nucleotiden
- Adapters: dubbelstrengs, 18-25 nucleotiden
- Probes: enkelstrengs, 100-1000 nucleotiden
1.5 DNA kopiëren: PCR en klonen
Zelf DNA kopiëren kan zowel in vitro als in vivo. In vivo kan het door PCR. In vivo door gene
cloning (HC2).
PCR staat voor Polymerase Chain Reaction. Er wordt geamplificeerd: heel veel gekopieerd.
Het is niet geschikt voor bijvoorbeeld hele chromosomen, maar wel voor stukken DNA van
100 tot 1500 nucleotiden. Voor de techniek is het handig om een video te bekijken (zie
opmerkingen bij slide 22 bij de PowerPoint HC1).
Je wilt de target-sequentie vermeerderen. Dit doe je door:
1. Het target DNA heel warm maken waardoor het gaat denatureren
2. Er worden twee primers neergezet (een forward en een reverse primer. Deze
verschillen van elkaar!). Het DNA koelt af en de primers kunnen gaan binden op de
begin- en eindstukken, maar de twee strengen moeten niet weer terug gaan binden,
dus ook weer niet te ver afkoelen.
3. Extensie: het DNA wordt verlengd en er komen nieuwe nucleotiden.
Pas bij de derde herhaling heb je je hele target sequentie en geen overige stukken.
5
