Zelfstudieopdracht: CRISPR-Cas9
Hoe kan je de CRISPR-Cas9 techniek gebruiken om een bepaald gen uit te schakelen?
Het CRISPR-Cas9 zorgt ervoor dat je een dubbelstrengige DNA breuk krijgt en hierna maakt deze
gebruik van de non-homologous end joining (zie hieronder uitgelegd) om vervolgens een gen te
kunnen uitschakelen. En vermits dit niet altijd foutloos verloopt, kan men er gemakkelijk een mutatie
op plaatsen om een gen te doen uitschakelen. Door het uitschakelen van dit gen, kan het gen zijn
functie niet meer doen. Deze uitschakeling kan bijvoorbeeld gebeuren door een mutatie van de
nucleotiden (kan gebeuren bij de non-homologous end joining), waardoor 3 opeenvolgende
nucleotiden een stopcodon vormen, hierdoor kunnen deze nucleotiden niet meer getranscripteerd
en getranslateerd worden in een proteïne en hierdoor kan dit gen niet meer werken (het gen wordt
dus uitgeschakeld). Er zijn verschillende andere manieren om een gen uit te schakelen, maar deze
zijn allemaal gebaseerd op non-homologous end joining met fouten.
Leg non-homologous end joining uit in je eigen woorden.
Non-homologous: je hebt geen ander deel van DNA nodig dat fungeert als een template.
End joing: de 2 eindes van de DNA-streng kunnen terug aan elkaar gemaakt worden
Alle cellen kunnen dit doen, omdat vaak de cellen breken en deze moeten dan gerepareerd worden,
dus alle zaken om dit te kunnen doen, zijn ook aanwezig in alle cellen. Wanneer je DNA dus
dubbelstrengig kapot is, of te wel dus door CRISPR-Cas9 geknipt is, zal een proteïne genaamd Ku
70/80 aan de eindes van je DNA binden. Een ander eiwit genaamd DNA protein kinase catalytic
subunit zal hieraan aangetrokken worden en hecht zich dan ook op de Ku 70/80. Samen worden de
eiwitten aangetrokken tot andere eiwitten, namelijk XRCC4 en XLF. Deze laatste eiwitten vormen een
spiraal rond het dubbelstrengig DNA, hierdoor worden de uiteindes van de DNA-ketens dichter bij
elkaar gebracht. Hierna zal DNA ligase 4 ervoor zorgen dat deze uiteindes terug aan elkaar worden
gemaakt, door zichzelf ertussen te plaatsen en zich vast te hechten aan beide uiteindes met
suikerfosfaatbindingen. Hierdoor is je DNA-keten terug volledig, maar dit gebeurt niet altijd foutloos,
bv. er ontbreekt een nucleotide.
Hoe kan je de CRISPR-Cas9 techniek gebruiken om een bepaald gen uit te schakelen?
Het CRISPR-Cas9 zorgt ervoor dat je een dubbelstrengige DNA breuk krijgt en hierna maakt deze
gebruik van de non-homologous end joining (zie hieronder uitgelegd) om vervolgens een gen te
kunnen uitschakelen. En vermits dit niet altijd foutloos verloopt, kan men er gemakkelijk een mutatie
op plaatsen om een gen te doen uitschakelen. Door het uitschakelen van dit gen, kan het gen zijn
functie niet meer doen. Deze uitschakeling kan bijvoorbeeld gebeuren door een mutatie van de
nucleotiden (kan gebeuren bij de non-homologous end joining), waardoor 3 opeenvolgende
nucleotiden een stopcodon vormen, hierdoor kunnen deze nucleotiden niet meer getranscripteerd
en getranslateerd worden in een proteïne en hierdoor kan dit gen niet meer werken (het gen wordt
dus uitgeschakeld). Er zijn verschillende andere manieren om een gen uit te schakelen, maar deze
zijn allemaal gebaseerd op non-homologous end joining met fouten.
Leg non-homologous end joining uit in je eigen woorden.
Non-homologous: je hebt geen ander deel van DNA nodig dat fungeert als een template.
End joing: de 2 eindes van de DNA-streng kunnen terug aan elkaar gemaakt worden
Alle cellen kunnen dit doen, omdat vaak de cellen breken en deze moeten dan gerepareerd worden,
dus alle zaken om dit te kunnen doen, zijn ook aanwezig in alle cellen. Wanneer je DNA dus
dubbelstrengig kapot is, of te wel dus door CRISPR-Cas9 geknipt is, zal een proteïne genaamd Ku
70/80 aan de eindes van je DNA binden. Een ander eiwit genaamd DNA protein kinase catalytic
subunit zal hieraan aangetrokken worden en hecht zich dan ook op de Ku 70/80. Samen worden de
eiwitten aangetrokken tot andere eiwitten, namelijk XRCC4 en XLF. Deze laatste eiwitten vormen een
spiraal rond het dubbelstrengig DNA, hierdoor worden de uiteindes van de DNA-ketens dichter bij
elkaar gebracht. Hierna zal DNA ligase 4 ervoor zorgen dat deze uiteindes terug aan elkaar worden
gemaakt, door zichzelf ertussen te plaatsen en zich vast te hechten aan beide uiteindes met
suikerfosfaatbindingen. Hierdoor is je DNA-keten terug volledig, maar dit gebeurt niet altijd foutloos,
bv. er ontbreekt een nucleotide.
