*Hoe kan een ziekteveroorzakend gen geïdentificeerd worden?
Twee belangrijke strategiën zijn gebruikt voor identificatie van ziektegenen.
Enerzijds functionele clonering waarbij op basis van klinische symptomen
vooropgesteld wordt welke eiwitten mogelijk deficiënt zouden kunnen zijn om zo het
gen coderend voor dit eiwit te identificeren. Deze strategie bleek uiteindelijk slechts
voor een minimaal aantal ziektebeelden succesvol te zijn.
Als alternatief werd rond 1980 de strategie van positionele clonering
gesuggereerd. Hierbij wordt getracht een ziektegen te identificeren in twee
stappen:
1. Localizatie ziektegen op het genoom2. Identificatie van ziektegen uit
kandidaatregio
* bespreek karyotype, hoe wordt het gevormd en wat kunnen we eruit afleiden
Karyotype is een beeld van een organisme zijn gedupleerde chromosomen, de
dupletten zijn verbonden via een centromeer. Bij de mens zou je 46 van deze
chromosomen, normaal gezien, moeten vinden wat wijst op 23 paar.
Praktisch: Celen worden gekweekt, aan de delende cellen wordt colchicine
toegevoegd wat er voor zorgt dat de mitose in metafase stopt. Dit is de meest
gecondenseerde (opgerolde) vorm van de chromosomen. De cellen moeten
opzwellen en worden gespreidt over en dekglaasje, met kleuring en fotografische
verwerking bekom je het karyotype.
We ordenen ze op grote. Het centromeer splitst een chromosoom op in korte (p)
arm en lange (q) arm. Aan elk uit einde van een chromosoom zit een telomeer. Aan
de hand van een karyotype kunnen we zien of er fouten zijn in de samenstelling van
genetisch materiaal bij een individu ( bijv aneuploidie, trisomie etc. )
* Beschrijf het verband tussen Malaria en Sikkelcelanemie
Sikkelcelanemie ontstaat door een mutatie in het globine gen. Natuurlijke selectie
zou normaal het mutant-allel doen verdwijnen uit de populatie; gebeurt niet in
streken waar Malaria voorkomt door de Plasmodium Falciparum -> overleeft niet in
een heterozygoot individu vd sikkelcelanemie-mutatie.
* Waarom was de tuinerwt een goede keuze van Mendel
De tuinerwt van Mendel was een goede keuze omdat deze een korte generatietijd
heeft en veel nakomelingen oplevert. Oftewel je kon snel resultaten van de kruising
zien en je moet altijd met grote getallen werken, omdat anders je resultaten niet
betrouwbaar zijn..
Hij koos bij de tuinerwt varieteiten die duidelijk maar zo weinig mogelijk
verschilden. Verder probeerde hij te vertrekken vanaf zuivere rassen en selecteerde
op stabiele kenmerken.
Bij de tuinerwt was kruisbestuiving mogelijk ipv zelfbestuiving, wat nodig is om te
kijken wat er gebeurd met het nageslacht bij kruising. De hybride planten die uit de
kruisingen kwamen bleken nog vruchtbaar te zijn, wat nodig is om verder te
kruisen.
*Wat is anticipatie en bespreek het moleculaire organisme wat hiervan aan de basis
ligt
Anticipatie is bij erfelijke aandoeningen die van generatie op generatie erger
worden. Dit kan zich uiten in veranderde klinische symptomen of/en een vervroegde
aanvangsleeftijd.
Deze ziekten worden veroorzaakt door een verlenging van een korte
herhalingssequentie die zich in het vertaalde of onvertaalde gebied van een gen
bevindt. Er is vaak een duidelijke correlatie tussen het aantal herhalingen en de
, ernst van de aandoening. Het aantal herhalingen neemt vaak toe van generatie op
generatie.
*Bespreek en vergelijk de methoden van next-sequencing generation
Er was een nood aan sequentie technologieën met een hoge capaciteit en met
weinig kosten.
- 454life science
Methode: Hierbij wordt gebruik gemaakt van pyrosequenering (techniek van 1995)
voordeel hiervan was dat er geen electroforetische scheiding nodig was, maar er
konden maar korte fragmenten worden geanalyseerd.
Gefragmenteerd DNA (nebulization – shearing met stikstof onder hoge druk) wordt
geligeerd met adapters. Daarna wordt 1 DNA fragment gebonden aan een
elektromagnetische korrel (bead). Er wordt een water/olie emulsie aangemaakt met
per druppel olie PCR-reagentia, 1 bead. In zo’n druppel wordt amplificatie van het
DNA fragment uitgevoerd. De emulsie wordt verbroken. Een bead met vele kopijen
word in een gaatje gedaan van een glaspaat, 1 bead per vakje. Dan volgt de
pyrosequencing met enzymen en primers gestart door deze toe te voegen.
Nucleotide 1 voor 1 aangeboden-inbouw nucleotide > ppi (pyrofosfaat) komt vrij en
ATP wordt hieruit gemaakt > omzetten luciferin naar oxyluciferin/licht. 100-150
nucleotiden lezen
- Solexa Combinatie van sequencing door DNA synthese en clustertechonolgie
DNA ligeert aan eindadapters, gedenatureerd en gebonden aan vaste drager (met
eindadapters). Uiteinde van het adapter zal ombuigen en binden aan andere
adapter > vervolgens exponentiele amplificatie. Hierna sequencing met primers >
inbouw van 1 gemerkte reversibele terminator nucleotide. Op basis van de kleur
kan de nucleotide van elke spot worden afgelezen. Daarna fluofoor en vervolgens
terminator verwijderen en cyclus begint opnieuw voor de volgende nucleotide.
30/35 nucleotiden aflezen.
- Applied biosystems – ABI solid (sequencing by oligo ligation and detection
Zelfde begin DNA ligeerd aan adapters. Geamplificeerd op beads door emulsie PCR.
DNA denaturatie. Beads op gasplaat laten binden waarover een vloeistof kan lopen.
Mengsel van octameren waarvan positie 4/5 vasthangen met een kleur, hybridisatie
en de kleur kan worden afgelezen. Hierna ligatie en cleavage van fragment om
fluorofoor te verwijderen. Cyclus herhaald zich. Er zijn 16 mogelijkheden, maar
enkel 4 kleuren > volgende cyclus geeft uitsluitsel omdat de base opnieuw wordt
gelezen. 30/35
454 kan de meeste nucleotiden in een keer lezen, maar werkt met DNA polymerase
wat het een dure techniek maakt.
Solid werkt als techniek niet zo efficiënt omdat je meerdere cyclussen door moet
voor dat je weet welk nucleotide zich er nou echt bevindt, wat het dus minder
maakt als de 454
Ook bij solexa moeten er steeds nevenreacties plaatsvinden voor je verder kan naar
het volgende nucleotide, al hoewel het al wel makkelijker werkt als solid
*Bespreek het verband tussen recombinatiefrequentie en genetische afstand.
De Genetische afstand wordt uitgedrukt in centiMorgans, wat wil zeggen: is er
Twee belangrijke strategiën zijn gebruikt voor identificatie van ziektegenen.
Enerzijds functionele clonering waarbij op basis van klinische symptomen
vooropgesteld wordt welke eiwitten mogelijk deficiënt zouden kunnen zijn om zo het
gen coderend voor dit eiwit te identificeren. Deze strategie bleek uiteindelijk slechts
voor een minimaal aantal ziektebeelden succesvol te zijn.
Als alternatief werd rond 1980 de strategie van positionele clonering
gesuggereerd. Hierbij wordt getracht een ziektegen te identificeren in twee
stappen:
1. Localizatie ziektegen op het genoom2. Identificatie van ziektegen uit
kandidaatregio
* bespreek karyotype, hoe wordt het gevormd en wat kunnen we eruit afleiden
Karyotype is een beeld van een organisme zijn gedupleerde chromosomen, de
dupletten zijn verbonden via een centromeer. Bij de mens zou je 46 van deze
chromosomen, normaal gezien, moeten vinden wat wijst op 23 paar.
Praktisch: Celen worden gekweekt, aan de delende cellen wordt colchicine
toegevoegd wat er voor zorgt dat de mitose in metafase stopt. Dit is de meest
gecondenseerde (opgerolde) vorm van de chromosomen. De cellen moeten
opzwellen en worden gespreidt over en dekglaasje, met kleuring en fotografische
verwerking bekom je het karyotype.
We ordenen ze op grote. Het centromeer splitst een chromosoom op in korte (p)
arm en lange (q) arm. Aan elk uit einde van een chromosoom zit een telomeer. Aan
de hand van een karyotype kunnen we zien of er fouten zijn in de samenstelling van
genetisch materiaal bij een individu ( bijv aneuploidie, trisomie etc. )
* Beschrijf het verband tussen Malaria en Sikkelcelanemie
Sikkelcelanemie ontstaat door een mutatie in het globine gen. Natuurlijke selectie
zou normaal het mutant-allel doen verdwijnen uit de populatie; gebeurt niet in
streken waar Malaria voorkomt door de Plasmodium Falciparum -> overleeft niet in
een heterozygoot individu vd sikkelcelanemie-mutatie.
* Waarom was de tuinerwt een goede keuze van Mendel
De tuinerwt van Mendel was een goede keuze omdat deze een korte generatietijd
heeft en veel nakomelingen oplevert. Oftewel je kon snel resultaten van de kruising
zien en je moet altijd met grote getallen werken, omdat anders je resultaten niet
betrouwbaar zijn..
Hij koos bij de tuinerwt varieteiten die duidelijk maar zo weinig mogelijk
verschilden. Verder probeerde hij te vertrekken vanaf zuivere rassen en selecteerde
op stabiele kenmerken.
Bij de tuinerwt was kruisbestuiving mogelijk ipv zelfbestuiving, wat nodig is om te
kijken wat er gebeurd met het nageslacht bij kruising. De hybride planten die uit de
kruisingen kwamen bleken nog vruchtbaar te zijn, wat nodig is om verder te
kruisen.
*Wat is anticipatie en bespreek het moleculaire organisme wat hiervan aan de basis
ligt
Anticipatie is bij erfelijke aandoeningen die van generatie op generatie erger
worden. Dit kan zich uiten in veranderde klinische symptomen of/en een vervroegde
aanvangsleeftijd.
Deze ziekten worden veroorzaakt door een verlenging van een korte
herhalingssequentie die zich in het vertaalde of onvertaalde gebied van een gen
bevindt. Er is vaak een duidelijke correlatie tussen het aantal herhalingen en de
, ernst van de aandoening. Het aantal herhalingen neemt vaak toe van generatie op
generatie.
*Bespreek en vergelijk de methoden van next-sequencing generation
Er was een nood aan sequentie technologieën met een hoge capaciteit en met
weinig kosten.
- 454life science
Methode: Hierbij wordt gebruik gemaakt van pyrosequenering (techniek van 1995)
voordeel hiervan was dat er geen electroforetische scheiding nodig was, maar er
konden maar korte fragmenten worden geanalyseerd.
Gefragmenteerd DNA (nebulization – shearing met stikstof onder hoge druk) wordt
geligeerd met adapters. Daarna wordt 1 DNA fragment gebonden aan een
elektromagnetische korrel (bead). Er wordt een water/olie emulsie aangemaakt met
per druppel olie PCR-reagentia, 1 bead. In zo’n druppel wordt amplificatie van het
DNA fragment uitgevoerd. De emulsie wordt verbroken. Een bead met vele kopijen
word in een gaatje gedaan van een glaspaat, 1 bead per vakje. Dan volgt de
pyrosequencing met enzymen en primers gestart door deze toe te voegen.
Nucleotide 1 voor 1 aangeboden-inbouw nucleotide > ppi (pyrofosfaat) komt vrij en
ATP wordt hieruit gemaakt > omzetten luciferin naar oxyluciferin/licht. 100-150
nucleotiden lezen
- Solexa Combinatie van sequencing door DNA synthese en clustertechonolgie
DNA ligeert aan eindadapters, gedenatureerd en gebonden aan vaste drager (met
eindadapters). Uiteinde van het adapter zal ombuigen en binden aan andere
adapter > vervolgens exponentiele amplificatie. Hierna sequencing met primers >
inbouw van 1 gemerkte reversibele terminator nucleotide. Op basis van de kleur
kan de nucleotide van elke spot worden afgelezen. Daarna fluofoor en vervolgens
terminator verwijderen en cyclus begint opnieuw voor de volgende nucleotide.
30/35 nucleotiden aflezen.
- Applied biosystems – ABI solid (sequencing by oligo ligation and detection
Zelfde begin DNA ligeerd aan adapters. Geamplificeerd op beads door emulsie PCR.
DNA denaturatie. Beads op gasplaat laten binden waarover een vloeistof kan lopen.
Mengsel van octameren waarvan positie 4/5 vasthangen met een kleur, hybridisatie
en de kleur kan worden afgelezen. Hierna ligatie en cleavage van fragment om
fluorofoor te verwijderen. Cyclus herhaald zich. Er zijn 16 mogelijkheden, maar
enkel 4 kleuren > volgende cyclus geeft uitsluitsel omdat de base opnieuw wordt
gelezen. 30/35
454 kan de meeste nucleotiden in een keer lezen, maar werkt met DNA polymerase
wat het een dure techniek maakt.
Solid werkt als techniek niet zo efficiënt omdat je meerdere cyclussen door moet
voor dat je weet welk nucleotide zich er nou echt bevindt, wat het dus minder
maakt als de 454
Ook bij solexa moeten er steeds nevenreacties plaatsvinden voor je verder kan naar
het volgende nucleotide, al hoewel het al wel makkelijker werkt als solid
*Bespreek het verband tussen recombinatiefrequentie en genetische afstand.
De Genetische afstand wordt uitgedrukt in centiMorgans, wat wil zeggen: is er
