4. Eiwitten
Complex, grote verscheidenheid, verschillende structuren (2nd, 3rd, 4th), dynamische regeling
(modificaties, etc.)
DNA dat zoveel mogelijk constant is.
Methoden 1 => bekijk massa-spectrometrie nog eens!
Methoden 2 => [eiwit], geheel van eiwitten
Methoden 3 => Naar een specifiek eiwit gaan kijken
4.1.
Sequentiebepaling Phenyl-IsoThioCyanaat (PITC)
4.1.1.
CyanaatEdman
is een reactieve groep
degradatie
die graag elektronen ontvangt
①
=> nucleofiele aanval!!
②
④
③ HPLC = High Performance
Liquid Chromatography
① eiwit van interesse + reagens PITC. Nucleofiele aanval waardoor er een binding ontstaat tussen
beide reagentia.
② pH-verandering reshuffling, laatste AZ wordt vastgehangen aan de fenylgroep (aromatisch)
③ HPLC zal AZ dat loskomt van peptide-keten identificeren. Wnr AZ loskomt van kolom geeft het de
info welk AZ het is.
,④ Stap per stap, telkens 1 AZ afsplitsen en na gaan welk AZ het is adhv. HPLC, Cyclisch!
Sequentiebepaling volgens Edman degradatie erg omslachtig, 40 à 60 AZ per peptide. Is nu
geautomatiseerd. Deze eiwitsequenties worden al in databanken opgeslagen (UniprotKB/SwissProt).
4.1.2. Eiwit sequentiebepaling via massa spectrometrie
DOEL: sequentiebepaling van een eiwit.
Stap 1: Protease digestie
We starten van een zuiver eiwit, bekomen door een 2D-gelelektroforese. We voegen proteasen toe
voor fragmentatie van de eiwitten, zo krijgen we een pool van peptiden afkomstig van zuiver eiwit.
Bij voorkeur met Trypsine, endopeptidase levert peptiden van ≤ 20AZ. Deze peptiden hebben een
C-terminaal basisch residu. Na ionisatie: 2 + ladingen: NH2 terminaal en C terminaal (eenvoudiger
spectrum als alle peptiden een dubbele lading hebben).
Stap 2: Scheiding eiwitfragmenten
Kolomchromatografie: bv. Reverse Phage 2D elektroforese voor zeer complexe mengsels,
verwijdert contaminanten (bv. buffercomponenten)
Directe koppeling met MS is mogelijk
4.1.2.1. MALDI-TOF
Matrix op staal aanbrengen en met laser licht op schijnen. Zo matrix activeren en gaan ladingen
overbrengen naar het eiwit. Moleculen met lading gaan we nu scheiden op massa, Time Of Flight
(TOF), hoe kleiner de moleculen = hoe sneller.
Ladingen nodig voor zowel scheiding als detectie. Zonder ladingen geen signaal.
MALDI is een manier om een molecule een lading te geven => LASER die op staal afvuurt
,Dan geladen moleculen scheiden volgens massa en lading met TOF
RESULTAAT = Fingerprint: Kijken in de databanken als ik een eiwit heb met al die ≠ massa’s
van fragmenten van peptiden, met welk eiwit komt dit dan overeen?
geen zuivere sequentie-bepaling, we kijken naar massa’s van peptiden.
4.1.2.2. MS/MS (verdere fragmentatie)
echte AZ-sequentie bepaling
Elektro Spray Ionisation, ESI => lading geven aan peptiden. Waarna de geladen peptiden overgaan tot
de Quadrupool. 4 metalen staven met wisselspanning oscillerende ionen met bepaalde massa. Ionen
met ≠ massa botsen tegen de rand. Zo selecteren op specifieke massa, door ionen 1 voor 1 door deze
quadrupool te laten gaan. Je kan massa kiezen => wisselstroom aan te passen.
- Q1: intacte peptides scheiden van elkaar volgens massa
- Q2: collision cell: komen met inert gas. Fragmenten uit eerste quadrupool laat met in Q2
botsen met een inert gas. Zo breken de fragmenten nog op in kleinere fragmenten.
Afhankelijk van de Energie van de fragmenten worden ze op verschillende plaatsen gesplitst.
- Q3: de massa van die fragmentjes gaan we hier meten. Als we goed de E kiezen waarmee de
fragmenten Q1 verlaten richting de collision cell in Q2, kunnen we na elk AZ een splitsing
krijgen => AZ-sequentie aflezen.
x, y, z => vanaf C-terminus splitsing
a, b, c => vanaf N-terminus splitsing
subscript wijst op aantal AZ’en in fragment
, Spectrum waaruit AZ-sequentie afgeleid kan worden. Heel moeilijk met isomeren (zelfde
atomen en massa), isobaren (gelijke massa maar ≠ atomen), massa dipeptiden, etc.
Gebruik van databases om eiwitten te identificeren
4.2. Proteoomanalyse
Methoden voor analyse van specifieke eiwitten.
Naar zoveel mogelijk eiwitten tegelijk kijken.
- Targeted = kijken naar vooraf geselecteerd
- Untargeted = wat zit er in?
- Differentiële proteomics = kijken naar verschillen tussen ≠ stalen in proteoom, next-
generation proteoomanalyse
4.2.1. Bulk analyse
Eiwit-identificatie en/of -kwantificatie van het volledige of gedeeltelijke proteoom
a) Untargeted
b) Targeted
c) Differentiële proteomics
d) Next generation
a.
Untargeted/exploratieve/discovery proteomics
1. BOTTOM-UP
Shotgun proteomics, eiwit knippen in peptide
waarna ze gescheiden en gesequenced
worden in MS
Identificatie mogelijk!
2. TOP-DOWN
Complex, grote verscheidenheid, verschillende structuren (2nd, 3rd, 4th), dynamische regeling
(modificaties, etc.)
DNA dat zoveel mogelijk constant is.
Methoden 1 => bekijk massa-spectrometrie nog eens!
Methoden 2 => [eiwit], geheel van eiwitten
Methoden 3 => Naar een specifiek eiwit gaan kijken
4.1.
Sequentiebepaling Phenyl-IsoThioCyanaat (PITC)
4.1.1.
CyanaatEdman
is een reactieve groep
degradatie
die graag elektronen ontvangt
①
=> nucleofiele aanval!!
②
④
③ HPLC = High Performance
Liquid Chromatography
① eiwit van interesse + reagens PITC. Nucleofiele aanval waardoor er een binding ontstaat tussen
beide reagentia.
② pH-verandering reshuffling, laatste AZ wordt vastgehangen aan de fenylgroep (aromatisch)
③ HPLC zal AZ dat loskomt van peptide-keten identificeren. Wnr AZ loskomt van kolom geeft het de
info welk AZ het is.
,④ Stap per stap, telkens 1 AZ afsplitsen en na gaan welk AZ het is adhv. HPLC, Cyclisch!
Sequentiebepaling volgens Edman degradatie erg omslachtig, 40 à 60 AZ per peptide. Is nu
geautomatiseerd. Deze eiwitsequenties worden al in databanken opgeslagen (UniprotKB/SwissProt).
4.1.2. Eiwit sequentiebepaling via massa spectrometrie
DOEL: sequentiebepaling van een eiwit.
Stap 1: Protease digestie
We starten van een zuiver eiwit, bekomen door een 2D-gelelektroforese. We voegen proteasen toe
voor fragmentatie van de eiwitten, zo krijgen we een pool van peptiden afkomstig van zuiver eiwit.
Bij voorkeur met Trypsine, endopeptidase levert peptiden van ≤ 20AZ. Deze peptiden hebben een
C-terminaal basisch residu. Na ionisatie: 2 + ladingen: NH2 terminaal en C terminaal (eenvoudiger
spectrum als alle peptiden een dubbele lading hebben).
Stap 2: Scheiding eiwitfragmenten
Kolomchromatografie: bv. Reverse Phage 2D elektroforese voor zeer complexe mengsels,
verwijdert contaminanten (bv. buffercomponenten)
Directe koppeling met MS is mogelijk
4.1.2.1. MALDI-TOF
Matrix op staal aanbrengen en met laser licht op schijnen. Zo matrix activeren en gaan ladingen
overbrengen naar het eiwit. Moleculen met lading gaan we nu scheiden op massa, Time Of Flight
(TOF), hoe kleiner de moleculen = hoe sneller.
Ladingen nodig voor zowel scheiding als detectie. Zonder ladingen geen signaal.
MALDI is een manier om een molecule een lading te geven => LASER die op staal afvuurt
,Dan geladen moleculen scheiden volgens massa en lading met TOF
RESULTAAT = Fingerprint: Kijken in de databanken als ik een eiwit heb met al die ≠ massa’s
van fragmenten van peptiden, met welk eiwit komt dit dan overeen?
geen zuivere sequentie-bepaling, we kijken naar massa’s van peptiden.
4.1.2.2. MS/MS (verdere fragmentatie)
echte AZ-sequentie bepaling
Elektro Spray Ionisation, ESI => lading geven aan peptiden. Waarna de geladen peptiden overgaan tot
de Quadrupool. 4 metalen staven met wisselspanning oscillerende ionen met bepaalde massa. Ionen
met ≠ massa botsen tegen de rand. Zo selecteren op specifieke massa, door ionen 1 voor 1 door deze
quadrupool te laten gaan. Je kan massa kiezen => wisselstroom aan te passen.
- Q1: intacte peptides scheiden van elkaar volgens massa
- Q2: collision cell: komen met inert gas. Fragmenten uit eerste quadrupool laat met in Q2
botsen met een inert gas. Zo breken de fragmenten nog op in kleinere fragmenten.
Afhankelijk van de Energie van de fragmenten worden ze op verschillende plaatsen gesplitst.
- Q3: de massa van die fragmentjes gaan we hier meten. Als we goed de E kiezen waarmee de
fragmenten Q1 verlaten richting de collision cell in Q2, kunnen we na elk AZ een splitsing
krijgen => AZ-sequentie aflezen.
x, y, z => vanaf C-terminus splitsing
a, b, c => vanaf N-terminus splitsing
subscript wijst op aantal AZ’en in fragment
, Spectrum waaruit AZ-sequentie afgeleid kan worden. Heel moeilijk met isomeren (zelfde
atomen en massa), isobaren (gelijke massa maar ≠ atomen), massa dipeptiden, etc.
Gebruik van databases om eiwitten te identificeren
4.2. Proteoomanalyse
Methoden voor analyse van specifieke eiwitten.
Naar zoveel mogelijk eiwitten tegelijk kijken.
- Targeted = kijken naar vooraf geselecteerd
- Untargeted = wat zit er in?
- Differentiële proteomics = kijken naar verschillen tussen ≠ stalen in proteoom, next-
generation proteoomanalyse
4.2.1. Bulk analyse
Eiwit-identificatie en/of -kwantificatie van het volledige of gedeeltelijke proteoom
a) Untargeted
b) Targeted
c) Differentiële proteomics
d) Next generation
a.
Untargeted/exploratieve/discovery proteomics
1. BOTTOM-UP
Shotgun proteomics, eiwit knippen in peptide
waarna ze gescheiden en gesequenced
worden in MS
Identificatie mogelijk!
2. TOP-DOWN
