Contents
5. Analyse van metabolieten en lipiden..................................................................................................2
5.1. Specifieke testen van individuele metabolieten..........................................................................2
5.2. Metabolomics..............................................................................................................................2
5.2.1. Via NMR................................................................................................................................3
5.2.2. Via MS...................................................................................................................................4
5.3. Metabole flux analyse (fluxomics)...............................................................................................4
5.3.1. Stable isotope-resolved metabolomics (SIRM)/Tracer metabolomics (via NMR of MS).......5
5.3.2. Metabolic flux analyzer (Seahorse).......................................................................................7
5.4. Analyse van lipiden......................................................................................................................8
5.4.1. Extractie van lipiden.............................................................................................................9
5.4.2. TLC / high performance TLC / 2D-TLC...................................................................................9
5.4.3. HPLC....................................................................................................................................10
5.4.4. GC.......................................................................................................................................11
5.4.5. MS-based lipidomics...........................................................................................................12
,5. Analyse van metabolieten en lipiden
Metaboliet
= elke organische molecule in het lichaam met een MW < 1500 Da
= peptiden, oligonucleotiden, suikers, nucleosiden, organische zuren, ketonen, aldehydes,
amines, aminozuren, lipiden, steroïden, xenobiotica
>200000 verschillende moleculen
Σ = metaboloom
Verbonden door metabole pathways
Belang:
- Metabolieten hebben vele functies: bouwstoffen voor macromoleculen, brandstof voor
energievoorziening, signaaltransductie, etc.
- Metabolisme integreert alle niveaus van cellulaire regulatie + omgevingsfactoren (dieet)
metaboloom is read-out van functioneren van een cel/organisme
- Δ metaboloom in vele complexe aandoeningen: kanker, obesitas, diabetes, etc.
Metabolomics toepassingen:
‘metabolic signatures’ van ziektetoestanden diagnose
Interventie mogelijk via dieet
Snelle analyse van therapierespons (bv. na orgaantransplantatie)
Probleem: Erg heterogene groep van moleculen.
5.1. Specifieke testen van individuele metabolieten
= traditionele metabolietanalyse
Vereist vaak specifieke opzuivering, optimalisering
van scheidingscondities, soms arbeidsintensief
RIA, HPLC, GC (gaschromatografie), CE, MS
Vaak enzymatische testen gekoppeld aan kleurreactie
bv. glucosetest voor diabetici.
5.2. Metabolomics
Metabolomics = allesomvattende en simultane analyse van metabolieten in een biologisch systeem
MetaboNomics = kwantitatieve analyse van een metabole respons op een stimulus Δ’en in het
metaboloom tgv. een stimulus.
, Staal pellet wassen snel invriezen
(quenchen)
Extractie met koude reagentia
Proteïne precipitatie
Quenchen = metabolisme zo snel
mogelijk stilleggen. We willen
metabolisme analyseren zoals het in de
cel is!
Apolair, alles wat niet Polair, alles wat oplost
oplost in water! in water!
5.2.1. Via NMR
NMR: spin van kernen met een oneven atoomgetal. Kern functioneert als een kleine magneet, deze
kleine magneet gaan we in een grote magneet zetten, oriëntatie volgens B 0. Radiogolf om spin van
kleine magneet om te draaien naar de hogere E-toestand.
Signaal is afhv. de elektronen-configuratie, deze schermen de kern af (kooi van Faraday) van
radiogolven. Afhv. de elektronen-configuratie gaan we verschillende radiofrequentie moeten
gebruiken. Spectrum met pieken die overeenkomen met protonen. Data afhv. protonen & B 0! Dus is
niet vergelijkbaar tussen labo’s. Oplossing hiervoor gebruikt met een standaard molecule (TMS) dat
we meten en aanvaarden als nulpunt.
# protonen op naburige C => # pieken in 1
piek. heel complex spectrum bij
complexere structuren.
Chemical shift = verschil in freq. nodig om
spins te draaien tov. freq. nodig om
standaardmolecule (TMS) spins te draaien.
5. Analyse van metabolieten en lipiden..................................................................................................2
5.1. Specifieke testen van individuele metabolieten..........................................................................2
5.2. Metabolomics..............................................................................................................................2
5.2.1. Via NMR................................................................................................................................3
5.2.2. Via MS...................................................................................................................................4
5.3. Metabole flux analyse (fluxomics)...............................................................................................4
5.3.1. Stable isotope-resolved metabolomics (SIRM)/Tracer metabolomics (via NMR of MS).......5
5.3.2. Metabolic flux analyzer (Seahorse).......................................................................................7
5.4. Analyse van lipiden......................................................................................................................8
5.4.1. Extractie van lipiden.............................................................................................................9
5.4.2. TLC / high performance TLC / 2D-TLC...................................................................................9
5.4.3. HPLC....................................................................................................................................10
5.4.4. GC.......................................................................................................................................11
5.4.5. MS-based lipidomics...........................................................................................................12
,5. Analyse van metabolieten en lipiden
Metaboliet
= elke organische molecule in het lichaam met een MW < 1500 Da
= peptiden, oligonucleotiden, suikers, nucleosiden, organische zuren, ketonen, aldehydes,
amines, aminozuren, lipiden, steroïden, xenobiotica
>200000 verschillende moleculen
Σ = metaboloom
Verbonden door metabole pathways
Belang:
- Metabolieten hebben vele functies: bouwstoffen voor macromoleculen, brandstof voor
energievoorziening, signaaltransductie, etc.
- Metabolisme integreert alle niveaus van cellulaire regulatie + omgevingsfactoren (dieet)
metaboloom is read-out van functioneren van een cel/organisme
- Δ metaboloom in vele complexe aandoeningen: kanker, obesitas, diabetes, etc.
Metabolomics toepassingen:
‘metabolic signatures’ van ziektetoestanden diagnose
Interventie mogelijk via dieet
Snelle analyse van therapierespons (bv. na orgaantransplantatie)
Probleem: Erg heterogene groep van moleculen.
5.1. Specifieke testen van individuele metabolieten
= traditionele metabolietanalyse
Vereist vaak specifieke opzuivering, optimalisering
van scheidingscondities, soms arbeidsintensief
RIA, HPLC, GC (gaschromatografie), CE, MS
Vaak enzymatische testen gekoppeld aan kleurreactie
bv. glucosetest voor diabetici.
5.2. Metabolomics
Metabolomics = allesomvattende en simultane analyse van metabolieten in een biologisch systeem
MetaboNomics = kwantitatieve analyse van een metabole respons op een stimulus Δ’en in het
metaboloom tgv. een stimulus.
, Staal pellet wassen snel invriezen
(quenchen)
Extractie met koude reagentia
Proteïne precipitatie
Quenchen = metabolisme zo snel
mogelijk stilleggen. We willen
metabolisme analyseren zoals het in de
cel is!
Apolair, alles wat niet Polair, alles wat oplost
oplost in water! in water!
5.2.1. Via NMR
NMR: spin van kernen met een oneven atoomgetal. Kern functioneert als een kleine magneet, deze
kleine magneet gaan we in een grote magneet zetten, oriëntatie volgens B 0. Radiogolf om spin van
kleine magneet om te draaien naar de hogere E-toestand.
Signaal is afhv. de elektronen-configuratie, deze schermen de kern af (kooi van Faraday) van
radiogolven. Afhv. de elektronen-configuratie gaan we verschillende radiofrequentie moeten
gebruiken. Spectrum met pieken die overeenkomen met protonen. Data afhv. protonen & B 0! Dus is
niet vergelijkbaar tussen labo’s. Oplossing hiervoor gebruikt met een standaard molecule (TMS) dat
we meten en aanvaarden als nulpunt.
# protonen op naburige C => # pieken in 1
piek. heel complex spectrum bij
complexere structuren.
Chemical shift = verschil in freq. nodig om
spins te draaien tov. freq. nodig om
standaardmolecule (TMS) spins te draaien.
