WERKCOLLEGE 1
SCHEIDING VAN PEPTIDEN VIA 2-DIMENSIONALE VLOEISTOF CHROMATOGRAFIE
Van alle monsters die men wil onderzoeken via Proteomics technieken worden de eiwitten verzameld.
Hierna worden de eiwitten met behulp van het protease trypsine in peptiden geknipt. Daarna heb je
voor elk monster misschien wel 100.000 peptiden gekregen. Deze moeten goed gescheiden worden om
ze één voor één te kunnen meten via massaspectrometrie. De scheiding wordt meestal uitgevoerd via
2dimensionale vloeistofchromatografie (2D-high performance liquid chromatography, 2D-HPLC).
Figuur 1. Schema van scheiding van peptiden via 2D vloeistofchromatografie
(MUDPIT). De eerste dimensie is een scheiding van peptiden via een strong-cation
exchange (SCX) kolom en de tweede dimensie is een scheiding via reversed phase
chromatografie (RPLC).
DE EERSTE DIMENSIE: STRONG CATION CHROMATOGRAFIE (SCX)
Vragen over SCX scheiding van peptiden:
• Wat is de samenstelling van de twee buffers bij SCX chromatografie, ofwel welke componenten
zitten in deze buffers?
- Buffer A bevat 25 mM NaCl, 0.1% mierenzuur (pH = 3)
- Buffer B bevat 300 mM NaCl, 0.1% mierenzuur (pH = 3)
1
, • Hoe krijg je ALLE peptiden in het monster positief geladen?
Door een lage pH, je zit onder de laagste pK van aminozuur dus zijn alle eiwitten positief geladen. De
peptiden zullen H+jes op gaan nemen.
• Welke component in de bindings-buffer zorgt dat de peptiden kunnen binden aan de SCX kolom?
Mierenzuur, want deze zorgt voor de lage pH.
• Welke component in de elutie-buffer zorgt dat peptiden van de kolom af komen?
Na+, deze verdringt de binding tussen de peptiden en de kolom.
• Dus wat is het principe van scheiding van peptiden via strong-cation chromatografie?
Je scheidt de peptiden op basis van lading.
Scheiding van de peptiden via SCX levert ongeveer 40 fracties op met verschillende soorten peptiden.
Bij een gelijkmatige scheiding bevinden zich dan nog 100.000/40 = 2500 soorten peptiden in een fractie.
Deze fracties worden één voor één op de volgende kolom gebracht: de C18-reversed phase kolom. De
2500 soorten peptiden worden op deze kolom verder van elkaar gescheiden. Belangrijk is dat deze
C18reversed phase kolom direct gekoppeld is aan de massaspectrometer via een capillair (diameter
ca. 1 µm) dat met goud gecoat is. Dus elk peptide dat van de C18-reversed phase kolom af komt, wordt
meteen de massaspectrometer in geleid, waarna de m/z wordt gemeten.
Deze laatste stap, de koppeling van de LC-stap met massaspectrometrie, wordt in wetenschappelijke
literatuur ook wel aangeduid met on-line LC-MS/MS.
Separation of peptides prior to mass spectrometry: on-line LC-MS
The many peptides of a sample are not introduced to the mass spectrometer all at once. Instead, they
are injected onto a microscale capillary reversed phase liquid chromatography column (RPLC column,
containing C18-resin) that is directly coupled to, or is ‘on-line’ with, the mass spectrometer. The
peptides are eluted from these columns using a solvent gradient of increasing organic content, so that
the peptide species elute in order of their hydrophobicity. Hydrophilic peptides elute first and when
the solvent gradient increases from low to high organic content the peptides that elute are more and
more hydrophobic.
As the mass spectrometer can distinguish the peptides by their masses, there is no need to separate
them into non-overlapping chromatographic peaks and usually many peptides arrive at the end of the
RPLC column at any given time. The signal intensity in the mass spectrum is directly proportional to the
peptide ion concentration, so the peptides are eluted in as small a volume as possible. This is achieved
by making the chromatographic column as small as can be packed uniformly and kept free of plugging,
which is usually between 50–150 μm in inner diameter. Such columns can be loaded with low μg
amounts of total peptide. The peptides are separated in approximately one hour. All peptides are
directly entering the mass spectrometer after being eluted (this is named ‘on-line’ LC-MS).
2
SCHEIDING VAN PEPTIDEN VIA 2-DIMENSIONALE VLOEISTOF CHROMATOGRAFIE
Van alle monsters die men wil onderzoeken via Proteomics technieken worden de eiwitten verzameld.
Hierna worden de eiwitten met behulp van het protease trypsine in peptiden geknipt. Daarna heb je
voor elk monster misschien wel 100.000 peptiden gekregen. Deze moeten goed gescheiden worden om
ze één voor één te kunnen meten via massaspectrometrie. De scheiding wordt meestal uitgevoerd via
2dimensionale vloeistofchromatografie (2D-high performance liquid chromatography, 2D-HPLC).
Figuur 1. Schema van scheiding van peptiden via 2D vloeistofchromatografie
(MUDPIT). De eerste dimensie is een scheiding van peptiden via een strong-cation
exchange (SCX) kolom en de tweede dimensie is een scheiding via reversed phase
chromatografie (RPLC).
DE EERSTE DIMENSIE: STRONG CATION CHROMATOGRAFIE (SCX)
Vragen over SCX scheiding van peptiden:
• Wat is de samenstelling van de twee buffers bij SCX chromatografie, ofwel welke componenten
zitten in deze buffers?
- Buffer A bevat 25 mM NaCl, 0.1% mierenzuur (pH = 3)
- Buffer B bevat 300 mM NaCl, 0.1% mierenzuur (pH = 3)
1
, • Hoe krijg je ALLE peptiden in het monster positief geladen?
Door een lage pH, je zit onder de laagste pK van aminozuur dus zijn alle eiwitten positief geladen. De
peptiden zullen H+jes op gaan nemen.
• Welke component in de bindings-buffer zorgt dat de peptiden kunnen binden aan de SCX kolom?
Mierenzuur, want deze zorgt voor de lage pH.
• Welke component in de elutie-buffer zorgt dat peptiden van de kolom af komen?
Na+, deze verdringt de binding tussen de peptiden en de kolom.
• Dus wat is het principe van scheiding van peptiden via strong-cation chromatografie?
Je scheidt de peptiden op basis van lading.
Scheiding van de peptiden via SCX levert ongeveer 40 fracties op met verschillende soorten peptiden.
Bij een gelijkmatige scheiding bevinden zich dan nog 100.000/40 = 2500 soorten peptiden in een fractie.
Deze fracties worden één voor één op de volgende kolom gebracht: de C18-reversed phase kolom. De
2500 soorten peptiden worden op deze kolom verder van elkaar gescheiden. Belangrijk is dat deze
C18reversed phase kolom direct gekoppeld is aan de massaspectrometer via een capillair (diameter
ca. 1 µm) dat met goud gecoat is. Dus elk peptide dat van de C18-reversed phase kolom af komt, wordt
meteen de massaspectrometer in geleid, waarna de m/z wordt gemeten.
Deze laatste stap, de koppeling van de LC-stap met massaspectrometrie, wordt in wetenschappelijke
literatuur ook wel aangeduid met on-line LC-MS/MS.
Separation of peptides prior to mass spectrometry: on-line LC-MS
The many peptides of a sample are not introduced to the mass spectrometer all at once. Instead, they
are injected onto a microscale capillary reversed phase liquid chromatography column (RPLC column,
containing C18-resin) that is directly coupled to, or is ‘on-line’ with, the mass spectrometer. The
peptides are eluted from these columns using a solvent gradient of increasing organic content, so that
the peptide species elute in order of their hydrophobicity. Hydrophilic peptides elute first and when
the solvent gradient increases from low to high organic content the peptides that elute are more and
more hydrophobic.
As the mass spectrometer can distinguish the peptides by their masses, there is no need to separate
them into non-overlapping chromatographic peaks and usually many peptides arrive at the end of the
RPLC column at any given time. The signal intensity in the mass spectrum is directly proportional to the
peptide ion concentration, so the peptides are eluted in as small a volume as possible. This is achieved
by making the chromatographic column as small as can be packed uniformly and kept free of plugging,
which is usually between 50–150 μm in inner diameter. Such columns can be loaded with low μg
amounts of total peptide. The peptides are separated in approximately one hour. All peptides are
directly entering the mass spectrometer after being eluted (this is named ‘on-line’ LC-MS).
2
