Samenvatting - Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1: hoofdstuk 11

Hoofdstuk 11: elektroforese en western blot
→ belang: technieken om (specifieke) biomoleculen van elkaar te scheiden

1) Introductie elektroforese

- Principe: scheiding van geladen deeltjes op basis van grootte doordat ze doorheen een gel
worden gestuurd onder invloed van elektrisch veld
o Elektrisch veld: laat geladen deeltjes bewegen
o Gel: 3D matrix die als een zeef werkt
- 2 gelsystemen:
o Agarose: polysacharide → scheiding van nucleïnezuren
 Horizontale gel
 Niet-toxisch
o Polyacrylamide: cross-linked polymeer van acrylamide → scheiding van eiwitten
 Acrylamide + methyleenbisacrylamide (=cross linker) + katalysatoren (=
TEMED of ammonium persulfaat
 Verticale cel + kleinere poriegrootte
 Onbewerkte acrylamide = neurotoxisch
 Denaturerende condities of natief
 Denaturerend = 3D structuur van eiwit wordt afgebroken: je
analyseert de lineaire AZ-sequentie
 Natief = biomoleculen hebben intacte structuur

2) Agarose gel elektroforese

- Scheiding van nucleïnezuren op een agarose gel
- Voorbereiden opstelling
o Gieten van agarose gel
 Agarose poeder + buffer → opwarmen zodat agarose smelt
 Buffer = TAE of TBE → tris-acetaat-EDTA of tris-boor-EDTA
 EDTA = bindt divalente kationen (Ca2+, Mg2+) want bv Mg wordt
gebruikt door enzymen die DNA en RNA afbreken
→ door EDTA toe te voegen stabiliseer je DNA en RNA
 Laten afkoelen in gelbakje met kam
o Staalvoorbereiding
 Laadbuffer toevoegen aan je DNA/RNA staal
 Kleurstoffen: zien hoe ver je staal migreert, maar bindt niet met DNA/RNA
zelf → broomfenolblauw of xyleencyanol
 Glycerol toevoegen: staal zwaarder maken zodat het staal in de gel blijft en
niet naar boven drijft in het water dat boven de gel wordt toegevoegd

o Gel laten lopen
 DNA stalen in “welletjes”
deponeren

,  DNA ladder/ marker toevoegen = mengsel van DNA fragmenten met gekende
lengte → referentiewaarden



o Visualiseren via bindende kleurstoffen
 Bij DNA/RNA binding geven bepaalde kleurstoffen een fluorescent signaal
onder UV of blauw licht
 Ethidiumbromide (EtBr):
 Signaal bij UV licht → ogen en huid beschermen + DNA beschadigt
 Zeer gevoelig (1-5 ng (nanogram))
 Toxisch en mutageen/ carcinogeen
 SYBRsafe:
 Blauw licht en UV licht
 Zeer gevoelig (1-5 ng)
 Minder mutageen, maar nog steeds toxisch
- Toepassingen:
o Lengte DNA fragment nakijken
o Scheiden van DNA fragmenten voor opzuiveren
 DNA fragmenten liggen door elektroforese verder uit elkaar → isoleren van 1
fragment door dit uit de gel te snijden
 DNA uit gelblokje isoleren/ zuiveren
o Nakijken integriteit RNA:
 RNA → veel rRNA → coderen voor 2 subeenheden ribosomen dus gaan 2
grote signalen uitzenden
 2 duidelijke ringen: RNA is intact
 Signaal is uitgesmeerd: RNA is gedegradeerd = afgebroken door RNase

- Gelpercentage bepaalt de poriegrootte van gelmatrix !!
→ hoe lager percentage, hoe groter de poriën, hoe verder DNA fragmenten kunnen migreren
→ je moet dus een percentage kiezen dat compatibel is met de DNA fragmenten die je wilt
analyseren!!

3) Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE)

- SDS-PAGE → scheiding volgens massa/grootte
o SDS = sodium dodecyl sulfaat = anionisch detergent
o Principe: denaturerende werking
 SDS toevoegen → bindt met aan aminozuren van eiwit → ontvouwt eiwit en
geeft een uniforme negatieve lading
 2-mercaptoethanol → disulfidebruggen breken
 Opwarmen tot 70°C → eiwit wordt beweeglijker en gaat makkelijke
ontvouwen (niet hoger als 70°C → samenklitten)
o Lineaire structuur met negatieve lading (proportioneel aan lengte & massa eiwit)
op/in de gel laden
o Negatieve pool aan kant van staal → elektrisch afstotend → migratie richting
positieve pool = elektrisch aantrekkend