Samenvatting - Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1: hoofdstuk 12

Hoofdstuk 12: celbiologische methoden
→ biologisch functioneren van cellen (ze doen aan allerhande processen) en deze processen kunnen
weergeven mbv specifieke methoden

1. Flow cytometrie

- Flow cytometrie: informatie over individuele cellen!!
o Bepalen welk % van de cellen een bepaalde merker bevat
- Vergelijkbaar met FACS (hfdst 3 en 8) maar ipv scheiding van cellen op het einde gaan ze
gewoon in de vuilbak
- Algemeen principe:
o Cellen analyseren adhv merkers die aangekleurd worden door fluorescent gelabelde
antilichamen
o Expressieprofiel van markers op cellen
 Op celoppervlak
 Intracellulair → plasmamembraan moet eerst toegankelijk gemaakt worden:
gaatjes in membraan gemaakt = permeabilisatie van membraan
o Gaan door buis en worden belicht door laser → op basis van licht dat wordt
teruggekaatst kan de detector een beeld geven van welke cellen er aanwezig zijn
- Je kan meerdere merkers tegelijk gebruiken!!
- Negatieve controle
= cellen worden niet gemerkt met fluorescente merker, maar doorlopen zelfde proces
→ achtergrondsignaal
→ nodig om grens tussen positief en negatief resultaat te trekken

- Resultaten worden weergegeven in




2. Celproliferatie

- BrdU test: celproliferatie meten
- Principe: BrdU = bromodeoxyuridine → thymidine analoog → tijdens S-fase ingebouwd ipv
Thymidine
- Werkwijze
o Cellen laten opgroeien
o BrdU toevoegen voor een 4-tal uur en verder laten groeien → BrdU wordt ingebouwd
in DNA tijdens S-fase
o Antilichaam Cy5 tegen BrdU toevoegen:
 Cel permeabiliseren (membraan toegankelijk maken zodat Cy5 in kern
terecht kan komen)
 Cy5 toevoegen

, o Merker meten → histogram
- Resultaat interpreteren:
o Blauwe lijn = negatieve controle
o Gele pieken = plekken waar cel prolifereert
 2 pieken = 2 populaties
 1e piek is onder blauwe controle = geen BrdU
aanwezig = niet actief aan het delen
 2e piek = wel BrdU aanwezig = wel actief aan het
delen

3. Celleefbaarheid

- MTT test: aantal levende cellen bepalen
- Principe:
Levende, intacte cellen hebben levende, intacte mitochondriën; deze litochondriën bevatten
mitochondriaal dehydrogenase die geel MTT kunnen omzetten in paars formazan
→ paarse kleuring is evenredig met aantal levende cellen
- Werkwijze
o Cellen laten groeien in 96-well plaat
o Gele MTT oplossing toevoegen en enkele uren laten incuberen in celcultuurincubator
o Optische densiteit/ absorptie meten op multi-well plaatlezer (= spectrofotometer)
→ hoe paarser, hoe meer levende en intacte cellen

- LET OP: dit is een indirecte meting!! Je moet opletten als je andere producten gaat gebruiken
die ook effect gaan hebben op aanwezige enzymen/ mitochondriale activiteit

4. Celdood

- Tunel test: meten van apoptose (breuken in DNA = dood)
o Principe: bij cellen in apoptose is er fragmentatie van DNA, hierdoor kan men Br-
dUTP inbouwen adhv enzyme TdT (= Terminaal deoxynucleotidyl Transferase)
o Werkwijze
 Weefselcoupe of celsuspensie (maken en) FIXEREN & permeabiliseren
 TdT en Br-dUTP toevoegen
 Antilichaam tegen Br-dUTP toevoegen → ingebouwd Br-dUTP detecteren
 Detectie met fluorescentie of histochemische kleuring
 Histochemie: kleuring → apoptotische cel wordt bruin gekleurd

- Propidium Iodide flow cytometrie: dode cellen tellen
o Principe: Propidium Iodide = PI kan enkel in dode cellen binnendringen → celkern:
binden aan DNA = intercaleren → geeft fluorescent signaal
o Werkwijze
 Cellen incuberen met PI
 Flow cytometrie
 PI fluorescentie → meer fluorescent signaal = meer PI = dode cel
 Forward Scatter (FSC) = “schaduw van de cel” → maat voor grootte
van de cel: levende cellen hebben grotere FSC dan dode cellen