Samenvatting - Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1: Hoofdstuk 13

Hoofdstuk 13: analyse van DNA
1. DNA inleiding




2. DNA extraheren
Algemeen principe
1. Lysis = afbreken van cellen zodat het DNA vrijkomt
→ lysaat = vloeistof met inhoud van gelyseerde cellen
2. Isoleren = DNA uit het lysaat halen of opzuiveren
→ RNA en eiwitten verwijderen
3. Oplossen = DNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, hierbij
concentreer je het DNA ook




Lyseren
- Vaak toevoegingen:
o Remmers van niet-gewenste moleculen: RNasen, proteasen,…
o EDTA = complexeert Mg2+ waardoor die wordt afgeschermd van DNase → DNase
inactief, anders wordt DNA afgebroken

- Lysis mbv detergent
o Meest gebruikte methode → snel, reproduceerbaar, geen specifieke apparatuur
o Bij celculturen toegepast
o Hydrofiele kop en hydrofobe kop
 Verdund voorkomen: monomeer
 Hoge concentratie in oplossing: micelle met hydrofiele koppen naar
buiten en hydrofobe staarten naar elkaar gericht

, o Milde detergent (CHAPS, triton, ...)
= behoud van celorganellen mogelijk + tragere lysis
o Harde detergent (SDS, …)
= ook organellen worden opengebroken + proteïnedenaturatie
o Principe van detergent
 Lipiden monomeren nestelen zich in het lipiden dubbelmembraan
 Buitenste membraan wordt langer als binnenste → membraan krijgt licht
kromming
 Op een bepaald moment: te harde buiging en membraan knapt open →
gaten in membraan
 Langs opening gaten worden er eerst halve micellen en uiteindelijk hele
micellen gevormd




- Mechanische methoden voor lysis
o Voor DNA is dit vaak te bruut, daarom dat men meestal detergenten prefereert




o Sonicator: hoge frequentiegolven maken ook het DNA kapot → vermijden als je
DNA wilt analyseren

- DNA uit bloed lyseren
o Anticoagulans = anti-bloedstolling → EDTA, want heparine inhibeert DNA reacties
o NH4Cl → lyseert cellen zonder kern (bv RBC → heemgroepen kunnen verdere
analyse inhiberen)
o Men wilt de WBC → met kern en dus DNA
→ verder gaan zoals bij de cellen

- DNA uit weefsels lyseren
o In kleine stukjes disseceren
o Met vloeibare stikstof → in mortier met pestel pletten tot een
poeder

, → verder gaan zoals bij cellen

- DNA uit cellen lyseren: met buffer
o SDS = detergent → afbreken membraan + eiwitten
o Enzymes: eiwitten en RNA afbreken
o EDTA: complexeert Mg → inhibitie DNase

DNA isoleren
- Organische solventen
o Scheiding DNA, RNA en eiwitten op basis van verschillende oplosbaarheid in
verschillende niet-mengbare vloeistoffen
o Voeg phenol-chloroform-isoamyl extractie toe + vortex (mengen)
 Phenol → denatureert eiwitten + minder polair dan water waardoor DNA
hier niet zal in oplossen
 Chloroform → verhoogt efficiëntie van eiwit denaturatie + denatureert
lipiden
 Isoamyl → vermindert schuimvorming
o Centrifugeer
 Pellet = organische fase met lipiden + interfase met proteïnen
 Supernatans = waterige fase met DNA
o Breng waterige fase over in nieuwe eppendorf

→ nadeel van deze manier: restanten van organische solventen in DNA + stoffen zijn
corrosief en toxisch

- Geconcentreerd zout
o Principe
 Voeg NaCl toe en centrifugeer → onttrekt sneller water van rond de
eiwitten dan rond DNA → eiwitten slaan neer en vormen pellet
 Supernatans bevat DNA → overbrengen naar nieuwe eppendorf
o Voordeel: eenvoudig, goedkoop en goede opbrengst & zuiverheid
o Na salting out & na phenol-chloroform extractie → ethanol precipitatie
(neerslaan van DNA) voor verdere opzuivering en concentratie van DNA (zie
verder)

- Kolomchromatografie
o Principe
 Bepaalde condities van zout en pH zorgen ervoor dat DNA aan matrix van
kolom bindt
 Andere condities zorgen voor elutie = vrijzetten van DNA
o Drijvende krachten van beweging doorheen kolom
 Centrifugatie
 Zwaartekracht
 Vacuüm

o Verschillende types
 Silica kolom