Daantje Lange
H4: Gentechnologie
4.1 DNA-technieken
4.1.1 Het kloneren van DNA-moleculen
4.1.1.1 Schematische voorstelling
- Isolatie/zuivering: het DNA wordt uit het weefsel, orgaan of cellen gehaald en eventueel
opgezuiverd
- Fragmentering: eventuele fragmentering van het gezuiverde DNA kan ofwel enzymatisch ofwel
mechanisch gebeuren
- Scheiding: de bekomen DNA fragmenten worden van elkaar gescheiden op basis van
fragmentlengte
- Ligatie: het/de te kloneren DNA fragment/fragmenten wordt in een vector gebracht (geligeerd)
met de vorming van recmbinante DNA moleculen tot gevolg
- Transformatie: de reconbinante DNAs worden in bacteriën gebracht om ze te vermeerderen
- Adressering: individuele kolonies worden opgepikt, naar aparte buisjes/microtiters overgebracht
en gecodeerd
4.1.1.2 Isolatie van DNA uit dierlijke cellen
Isolatie en zuivering bestaat meestal uit 2 stappen:
1. Openbreken van de cel
2. Scheiding van het DNA van het overige celmateriaal, zoals RNA en eiwitten
Er bestaan tal van verschillende methoden. Welke methode gebruikt zal worden hangt grotendeels af
van het staaltype en de downstream toepassingen. Meestal wordt gewerkt met kleine tot heel kleine
DNA fragmenten is de lengte van de bekomen DNA fragmenten niet zo belangrijk meer.
Als staaltype kan theoretisch vertrokken worden van eender welk materiaal waar DNA in zit. De
meest courante staaltypes zijn bloed, sperma, haarwortels en mond swabs. Alternatief:
biopsiemateriaal, feces, urine, melk, baarmoedervocht, museumstukken, archeologisch materiaal, …
De eenvoudige, veelgebruikte en goedkope methode die DNA oplevert dat in veel toepassingen kan
worden gebruikt bestaat uit de volgende stappen:
Pagina 1 van 38
, Daantje Lange
- Openbreken van de cellen door ze in een buffer te brengen met een detergent (meestal SDS)
- In aanwezigheid van EDTA de proteïnen afbreken met proteïnase K
- DNA van gecontamineerde eiwitten scheiden door extractie met fenol en chloroform. De eiwitten
worden gedenatureerd door de fenol, en in de organische fenol/chloroform fase verwijderd
terwijl het DNA in de waterige fase blijft
Indien nodig kan daarna het RNA verwijderd worden door behandeling met RNase. Dit is een enzym
dat RNA afbreekt en DNA ongemoeid laat. Alternatief (omslachtiger) kan het RNA eveneens worden
verwijderd door precipitatie met ammoniumacetaat.
4.1.1.3 Het fragmenteren/knippen van DNA-moleculen
Langere DNA fragmenten kunnen mechanisch of enzymatisch gefragmenteerd worden. De broosheid
van lineair DNA kan in het labo gebruikt worden om het op een gemakkelijke manier te fragmenteren
door bijv. de DNA oplossing een aantal keren krachtig op en neer te pipetteren of door sonicatie
(ultrageluidsgolven).
Het voordeel van mechanisch fragmenteren is dat het breken van de DNA-strengen willekeurig is en
fragmenten van min of meer gelijke lengte oplevert. Deze methode wordt daarom veel ebruikt bij het
maken van de DNA bibliotheken voor sequencing van volledige genomen. Het willekeurig breken van
de DNA-strengen is tegelijk ook een nadeel aangezien de uiteinden gelijk welke sequentie kunnen
hebben, wat een extra stap vereist om de fragmenten klaar te maken voor ligatie.
DNA enzymatisch fragmenteren heeft net de omgekeerde voor- en nadelen. Het DNA wordt
gefragmenteerd (geknipt) op welbepaalde plaatsen waarvan de sequentie steeds dezelfde is. Dit
maakt het ligeren eenvoudiger, maar heeft tot gevolg dat de lengte van de bekomen fragmenten sterk
afhankelijk is van de aanwezige herkenningsplaatsen en dus sterk kan verschillen.
Welke van beide methoden gebruikt zal worden hangt dus ook grotendeels af van de navolgende
toepassingen. Over het algemeen wordt mechanisch fragmenteren gebruikt indien met een grote
hoeveelheid fragmenten tegelijk wordt gewerkt, en de enzymatische methode indien wordt gewerkt
met individuele fragmenten.
Het knippen van het DNA gebeurt met behulp van speciale enzymen, de restrictie endonucleasen.
Dit zijn enzymen die een welbepaalde sequentie (restrictieplaats) in een DNA smolecule herkennen
en die twee enkelstrengige breuken maken, één in elke streng van het DNA, en aldus een vrije 3’-OH
groep aan het ene uiteinde van de streng en een 5’-P groep aan het andere uiteinde van de streng
genereren.
De restrictieplaatsen zijn gewoonlijk palindromen: de sequentie is identiek in beide DNA-strengen,
bestaande uit 4, 6 of 8 basenparen.
Er worden twee hoofdtypes restrictie enzymen onderscheiden:
- Type I enzymen knippen het DNA buiten hun herkenningsplaats
- Type II enzymen knippen in hun herkenningsplaats
Pagina 2 van 38
, Daantje Lange
Restrictie enzymen worden genoemd naar de bacterie waaruit de worden geïsoleerd. Ze krijgen een
drielettercode gevolgd door eventueel een bijkoemnd cijfer of letter om de bacteriestam aan te
duiden.
Host restriction: het eigen DNA wordt tegen inwerking van het eigen restrictie enzym beschermd
doordat ze restrictieplaatse gemodificeerd zijn dodanig dat het RE er niet meer kan knippen. Deze
modificatie wordt uitgevoerd door celeigen methylasen die een methylgroep toe te voegen aan
cytosine of adenine en deze aldus om te zetten tot 5-methylcytosine en N-6-methyladenine, en dit
zonder dat deze nucleotiden hun coderende eigenschappen verliezen.
De frequentie waarmee een restrictie enzym een stuk DNA zal knippen hangt af van:
- Het aantal herkenningsplaatsen van het enzym. In de regel zal een RE met een herkenningsplaats
van vier nucleotiden meer knippen dan een RE met een herkenningsplaats van zes of meer
nucleotiden
- De nucleotidensamenstelling (sequentie) van de RE herkenningsplaats. Zoals eerder uitgelegd
komt CG 4 keer minder voor dan GC waardoor RE’s met CG in hun herkenningsplaats relatief
weinig zullen knippen (is altijd van 5’ → 3’)
- De gevoeligheid voor methylatie van het RE en de methylatiegraad van het te knippen DNA
4.1.1.4 Scheiding van DNA-moleculen: gelelektroforese
Gelelektroforese is een veelvuldig gebruikte techniek voor het scheiden van lineaire DNA fragmenten
op basis van hun lengte. We hebben verschillende technieken:
- Agarose elekrtoforese: scheiding 50 bp tot 40.000 bp (resolutie 10 bp)
- Pulsed field gel elektroforese: 5000 bp tot 10 Mbp (resolutie 5 kbp)
- Polyacrylamide elektroforese: 10 bp tot 1000 bp (resolutie 1 bp)
De keuze van welke methode gebruikt zal worden hangt grotendeels af van de grootte van de te
scheiden DNA fragmenten en van de resolutie (scheidend vermogen) die wordt beoogd.
Pagina 3 van 38
, Daantje Lange
Agarose gelelektroforese
Agarosegels worden gemaakt door de agarose in een gewenste buffer te smelten tot een
transparante oplossing en ze vervolgens in een gietvorm te laten stollen tot een gel. De gel wordt
aangebracht in een buffertank voorzien van twee tegenover geplaatste elektroden. In de gel worden
uitsparingen voorzien waarin de stalen met het te scheiden DNA wordt aangebracht.
Onder invloed van een elektrische gelijkstroom migreren de DNA
fragmenten van de negatieve (kathode) naar de positieve (anode) pool
(DNA is immers negatief geladen) met een snelheid die enkel
afhankelijk is van hun grootte en hun conformatie. Wanneer enkel
lineaire fragmenten aanwezig zijn migreren de fragmenten van de
kathode naar de anode met een snelheid in overeenstemming met de
logaritme van hun moleculair gewicht m.a.w. de kleinste fragmenten
bewegen het snelst door de mazen aanwezig in het dichte netwerk van
de gel.
De DNA fragmenten in de gel worden zichtbaar gemaakt door toevoegen van ethidiumbromide (EtBr,
een intercalerend mutageen!) of een analoog werkende kleurstof en bekijken van de gel onder UV-
licht.
De grootte van de DNA fragmenten in de stalen wordt geschat door vergelijking met DNA fragmenten
waarvan de lengte exact gekend is.
De grootte dan de DNA fragmenten die van elkaar gescheiden kunnen worden en de resolutie hangen
in het algemeen af van de poriegrootte van de gelmatrix. DNA fragmenten groter dan 40 kbp kunnen
niet doorheen de poriën migreren en kunnen niet van elkaar gescheiden worden. Fragmenten kleiner
dan 10 bp lopen meteen door de gel en de hoogste resolutie die verkregen kan worden ligt ergens
rond de 10 à 20 bp, afhankelijk van het % agarose.
Pulsed field gelelektroforese
Voor de scheiding van grote DNA fragmenten wordt deze
variant van de agarose gelelektroforese gebruikt. Hierbij
wordt eveneens gebruik gemaakt van agarosegels en
bijhorende buffer maar de opstelling en het aantal van de
elektroden is verschillend van de klassieke agarose
gelelektroforese.
Wellicht de meest gebruikte is de ‘’contour clamped
homogenous elektric field’’ ofwel CHEF. Deze toestellen
bezitten 24 platina elektroden die een alternerend veld
creëren, onder invloed waarvan het DNA zich al zigzaggend door de gel beweegt waarbij de
uiteindelijke scheiding een patroon oplevert vergelijkbaar met dat in conventionele agarosegels.
Pagina 4 van 38
H4: Gentechnologie
4.1 DNA-technieken
4.1.1 Het kloneren van DNA-moleculen
4.1.1.1 Schematische voorstelling
- Isolatie/zuivering: het DNA wordt uit het weefsel, orgaan of cellen gehaald en eventueel
opgezuiverd
- Fragmentering: eventuele fragmentering van het gezuiverde DNA kan ofwel enzymatisch ofwel
mechanisch gebeuren
- Scheiding: de bekomen DNA fragmenten worden van elkaar gescheiden op basis van
fragmentlengte
- Ligatie: het/de te kloneren DNA fragment/fragmenten wordt in een vector gebracht (geligeerd)
met de vorming van recmbinante DNA moleculen tot gevolg
- Transformatie: de reconbinante DNAs worden in bacteriën gebracht om ze te vermeerderen
- Adressering: individuele kolonies worden opgepikt, naar aparte buisjes/microtiters overgebracht
en gecodeerd
4.1.1.2 Isolatie van DNA uit dierlijke cellen
Isolatie en zuivering bestaat meestal uit 2 stappen:
1. Openbreken van de cel
2. Scheiding van het DNA van het overige celmateriaal, zoals RNA en eiwitten
Er bestaan tal van verschillende methoden. Welke methode gebruikt zal worden hangt grotendeels af
van het staaltype en de downstream toepassingen. Meestal wordt gewerkt met kleine tot heel kleine
DNA fragmenten is de lengte van de bekomen DNA fragmenten niet zo belangrijk meer.
Als staaltype kan theoretisch vertrokken worden van eender welk materiaal waar DNA in zit. De
meest courante staaltypes zijn bloed, sperma, haarwortels en mond swabs. Alternatief:
biopsiemateriaal, feces, urine, melk, baarmoedervocht, museumstukken, archeologisch materiaal, …
De eenvoudige, veelgebruikte en goedkope methode die DNA oplevert dat in veel toepassingen kan
worden gebruikt bestaat uit de volgende stappen:
Pagina 1 van 38
, Daantje Lange
- Openbreken van de cellen door ze in een buffer te brengen met een detergent (meestal SDS)
- In aanwezigheid van EDTA de proteïnen afbreken met proteïnase K
- DNA van gecontamineerde eiwitten scheiden door extractie met fenol en chloroform. De eiwitten
worden gedenatureerd door de fenol, en in de organische fenol/chloroform fase verwijderd
terwijl het DNA in de waterige fase blijft
Indien nodig kan daarna het RNA verwijderd worden door behandeling met RNase. Dit is een enzym
dat RNA afbreekt en DNA ongemoeid laat. Alternatief (omslachtiger) kan het RNA eveneens worden
verwijderd door precipitatie met ammoniumacetaat.
4.1.1.3 Het fragmenteren/knippen van DNA-moleculen
Langere DNA fragmenten kunnen mechanisch of enzymatisch gefragmenteerd worden. De broosheid
van lineair DNA kan in het labo gebruikt worden om het op een gemakkelijke manier te fragmenteren
door bijv. de DNA oplossing een aantal keren krachtig op en neer te pipetteren of door sonicatie
(ultrageluidsgolven).
Het voordeel van mechanisch fragmenteren is dat het breken van de DNA-strengen willekeurig is en
fragmenten van min of meer gelijke lengte oplevert. Deze methode wordt daarom veel ebruikt bij het
maken van de DNA bibliotheken voor sequencing van volledige genomen. Het willekeurig breken van
de DNA-strengen is tegelijk ook een nadeel aangezien de uiteinden gelijk welke sequentie kunnen
hebben, wat een extra stap vereist om de fragmenten klaar te maken voor ligatie.
DNA enzymatisch fragmenteren heeft net de omgekeerde voor- en nadelen. Het DNA wordt
gefragmenteerd (geknipt) op welbepaalde plaatsen waarvan de sequentie steeds dezelfde is. Dit
maakt het ligeren eenvoudiger, maar heeft tot gevolg dat de lengte van de bekomen fragmenten sterk
afhankelijk is van de aanwezige herkenningsplaatsen en dus sterk kan verschillen.
Welke van beide methoden gebruikt zal worden hangt dus ook grotendeels af van de navolgende
toepassingen. Over het algemeen wordt mechanisch fragmenteren gebruikt indien met een grote
hoeveelheid fragmenten tegelijk wordt gewerkt, en de enzymatische methode indien wordt gewerkt
met individuele fragmenten.
Het knippen van het DNA gebeurt met behulp van speciale enzymen, de restrictie endonucleasen.
Dit zijn enzymen die een welbepaalde sequentie (restrictieplaats) in een DNA smolecule herkennen
en die twee enkelstrengige breuken maken, één in elke streng van het DNA, en aldus een vrije 3’-OH
groep aan het ene uiteinde van de streng en een 5’-P groep aan het andere uiteinde van de streng
genereren.
De restrictieplaatsen zijn gewoonlijk palindromen: de sequentie is identiek in beide DNA-strengen,
bestaande uit 4, 6 of 8 basenparen.
Er worden twee hoofdtypes restrictie enzymen onderscheiden:
- Type I enzymen knippen het DNA buiten hun herkenningsplaats
- Type II enzymen knippen in hun herkenningsplaats
Pagina 2 van 38
, Daantje Lange
Restrictie enzymen worden genoemd naar de bacterie waaruit de worden geïsoleerd. Ze krijgen een
drielettercode gevolgd door eventueel een bijkoemnd cijfer of letter om de bacteriestam aan te
duiden.
Host restriction: het eigen DNA wordt tegen inwerking van het eigen restrictie enzym beschermd
doordat ze restrictieplaatse gemodificeerd zijn dodanig dat het RE er niet meer kan knippen. Deze
modificatie wordt uitgevoerd door celeigen methylasen die een methylgroep toe te voegen aan
cytosine of adenine en deze aldus om te zetten tot 5-methylcytosine en N-6-methyladenine, en dit
zonder dat deze nucleotiden hun coderende eigenschappen verliezen.
De frequentie waarmee een restrictie enzym een stuk DNA zal knippen hangt af van:
- Het aantal herkenningsplaatsen van het enzym. In de regel zal een RE met een herkenningsplaats
van vier nucleotiden meer knippen dan een RE met een herkenningsplaats van zes of meer
nucleotiden
- De nucleotidensamenstelling (sequentie) van de RE herkenningsplaats. Zoals eerder uitgelegd
komt CG 4 keer minder voor dan GC waardoor RE’s met CG in hun herkenningsplaats relatief
weinig zullen knippen (is altijd van 5’ → 3’)
- De gevoeligheid voor methylatie van het RE en de methylatiegraad van het te knippen DNA
4.1.1.4 Scheiding van DNA-moleculen: gelelektroforese
Gelelektroforese is een veelvuldig gebruikte techniek voor het scheiden van lineaire DNA fragmenten
op basis van hun lengte. We hebben verschillende technieken:
- Agarose elekrtoforese: scheiding 50 bp tot 40.000 bp (resolutie 10 bp)
- Pulsed field gel elektroforese: 5000 bp tot 10 Mbp (resolutie 5 kbp)
- Polyacrylamide elektroforese: 10 bp tot 1000 bp (resolutie 1 bp)
De keuze van welke methode gebruikt zal worden hangt grotendeels af van de grootte van de te
scheiden DNA fragmenten en van de resolutie (scheidend vermogen) die wordt beoogd.
Pagina 3 van 38
, Daantje Lange
Agarose gelelektroforese
Agarosegels worden gemaakt door de agarose in een gewenste buffer te smelten tot een
transparante oplossing en ze vervolgens in een gietvorm te laten stollen tot een gel. De gel wordt
aangebracht in een buffertank voorzien van twee tegenover geplaatste elektroden. In de gel worden
uitsparingen voorzien waarin de stalen met het te scheiden DNA wordt aangebracht.
Onder invloed van een elektrische gelijkstroom migreren de DNA
fragmenten van de negatieve (kathode) naar de positieve (anode) pool
(DNA is immers negatief geladen) met een snelheid die enkel
afhankelijk is van hun grootte en hun conformatie. Wanneer enkel
lineaire fragmenten aanwezig zijn migreren de fragmenten van de
kathode naar de anode met een snelheid in overeenstemming met de
logaritme van hun moleculair gewicht m.a.w. de kleinste fragmenten
bewegen het snelst door de mazen aanwezig in het dichte netwerk van
de gel.
De DNA fragmenten in de gel worden zichtbaar gemaakt door toevoegen van ethidiumbromide (EtBr,
een intercalerend mutageen!) of een analoog werkende kleurstof en bekijken van de gel onder UV-
licht.
De grootte van de DNA fragmenten in de stalen wordt geschat door vergelijking met DNA fragmenten
waarvan de lengte exact gekend is.
De grootte dan de DNA fragmenten die van elkaar gescheiden kunnen worden en de resolutie hangen
in het algemeen af van de poriegrootte van de gelmatrix. DNA fragmenten groter dan 40 kbp kunnen
niet doorheen de poriën migreren en kunnen niet van elkaar gescheiden worden. Fragmenten kleiner
dan 10 bp lopen meteen door de gel en de hoogste resolutie die verkregen kan worden ligt ergens
rond de 10 à 20 bp, afhankelijk van het % agarose.
Pulsed field gelelektroforese
Voor de scheiding van grote DNA fragmenten wordt deze
variant van de agarose gelelektroforese gebruikt. Hierbij
wordt eveneens gebruik gemaakt van agarosegels en
bijhorende buffer maar de opstelling en het aantal van de
elektroden is verschillend van de klassieke agarose
gelelektroforese.
Wellicht de meest gebruikte is de ‘’contour clamped
homogenous elektric field’’ ofwel CHEF. Deze toestellen
bezitten 24 platina elektroden die een alternerend veld
creëren, onder invloed waarvan het DNA zich al zigzaggend door de gel beweegt waarbij de
uiteindelijke scheiding een patroon oplevert vergelijkbaar met dat in conventionele agarosegels.
Pagina 4 van 38
