Biotechnologie Les 5: designing, purifying and understand antibodies
Opwarming: Ab, fragmenten en equivalente moleculen
Ab en hun derivaten
- 150 kDa: 4 polypeptiden van 2 genen met 2 zware en 2 lichte ketens
assembleren in gastheer tot een IgG van volledige lengte.
- Sterkte antigenbinding = functie van variabele domeinen in terminale
fragment.
IgG expressie
- Individuele peptiden kunnen tot expressie gebracht worden in E. Coli.
o Niet geglycosyleerd
o Verminderde omgeving van cytoplasma stopt assemblage
Ze kunnen op zichzelf vouwen maar Cys-bruggen nodig tussen EW om te
assembleren tot de correcte structuur: cytoplasma E. Coli daar niet
bevorderlijk voor
o Zonder assemblage zijn EW niet stabiel makkelijk aggregeren
- Bij voorkeur: eukaryote gastheer = gist of hybridoma’s / welke Ab chassis.
o Ab (full length) van volledige lengte, chaperones nodig om te vouwen en
glycosylering voor functie: eukaryote gastheer kan beiden bieden.
o Chassis = Ab-ruggengraat (muis, chimeeer, gehumaniseerd en menselijk): centraal
onderdeel in fabricageproces beschrijven waaraan u nog onderdelen toevoegt.
Menselijk = minst immunogeen
Gehumaniseerd: minste aanpassingen of optimalisatie voor therapeutica.
Muis mAb: therapeutisch of diagnostisch
Immunogeniciteit van muis Ab verminderen:
o Fv overbrengen naar gehumaniseerde chassis chimeer Ab
o Alleen CDR-lussen, die direct contact maken met antigen,
overbrengen naar gehumaniseerde chassis.
IgG fragmenten
- Levensvatbaar biotherapeuticum zolang de antigen binding behouden blijft
- Geen volledige IgG nodig voor functie: zolang Fv behouden blijft en binding mogelijk is, kan
dit molecule gebruikt worden voor functie.
o Humaan Ab of gehumaniseerde chassis: 2 fragmenten/ketens voor een volledig Fv,
dus dAbs niet optimaal
Andere natuurlijke Ab-structuren
- Haaien-Ab en kameelachtigen-Ab: binden met hoge affiniteit vanuit een enkel domein (scFv).
o Top of IgG equivalent: geen dubbele keten voor binding maar singel domein capabel
voor het bereiken van de hoge affiniteit, hetzelfde een humaan Ab zou bereiken.
- Fragmenten daarvan kunnen ook gebruikt worden:
o Nanobodies = kameelachtig singel dAbs (kleiner dan scFv): VHH-domein.
,Biotechnologie Les 5: designing, purifying and understand antibodies
EW ontworpen voor binding
- Patroon voor succesvolle EW = lage immunogeniciteit.
- Patroon in hun ontwikkeling = gerichte evolutie
- Toepassingen gaan verder dan biotherapeutica
o Diagnostische reagentia = ELISA
o Biotechnologische toepassingen = EW-zuivering, verbeterde PCR
o Onderzoeksmiddelen = Ab-fluorescerende EW-fusies
o Bioremediatie = metaalbindende peptiden
, Biotechnologie Les 5: designing, purifying and understand antibodies
EW productie in andere gastheren
Relevante gastheren voor op grote schaal EW-expressie
Sterktes Limitaties
Prokaryoten - Makkelijk manipuleren (incl: - Minimale post-
- E. coli ontwikkelen) translatie modificatie
- Grote schaal fermentatie (PTM)
- Eenvoudige en goedkope grondstof - Laagste ondersteuning
- Hoge opbrengt (yield) voor EW-vorming
Gisten - Makkelijk manipuleren - PTM kan anders zijn
- Pichia pastoris - Grote schaal fermentatie bij de mens
- Hoge opbrengst
Mammalia cel - Alle PTM beschikbaar - Trage groei
- CHO = chinese - Kan groeien in suspensie - Moeilijk opschalen
hamster ovary - Duur
- Afhankelijk van serum
Vereisten voor EW-expressie in nieuwe gastheer
- Methode om gastheer te transformeren.
o Waar DNA in gastheer inbrengen is niet gegeven
Bacterie: geslachtsgebonden elektroporatie in staat om DNA in cel af te
geven inefficiënt voor complexere cellen owv celwanden = algen,
plantencellen.
- Geschikte vector: stabiel
o Plasmide (E. Coli): maar zijn niet allemaal stabiel
o Shuttle vector = plasmide dat groeit: bezit alles om te groeien in een andere gastheer
- Selectiemarkering
o Kan gebruikt worden in de gastheer die je transformeert
o Bij shuttle vector: werkt op origineel organisme en
bestemmingsorganisme.
- Bekende onderdelen (promotor, RBS, terminator)
pRS
= diverse en meest populaire familie van shuttle-plasmiden voor E. Coli en gist.
- Gist: shuttle vector = deel van sequentie voor replicatie van bacteriën en
ander deel van sequentie voor replicatie van gisten.
- Strategie om vectoren te creëeren waar je efficiënt in E. Coli kan werken en dan verplaatsen
naar productie streng (=gist).
Opwarming: Ab, fragmenten en equivalente moleculen
Ab en hun derivaten
- 150 kDa: 4 polypeptiden van 2 genen met 2 zware en 2 lichte ketens
assembleren in gastheer tot een IgG van volledige lengte.
- Sterkte antigenbinding = functie van variabele domeinen in terminale
fragment.
IgG expressie
- Individuele peptiden kunnen tot expressie gebracht worden in E. Coli.
o Niet geglycosyleerd
o Verminderde omgeving van cytoplasma stopt assemblage
Ze kunnen op zichzelf vouwen maar Cys-bruggen nodig tussen EW om te
assembleren tot de correcte structuur: cytoplasma E. Coli daar niet
bevorderlijk voor
o Zonder assemblage zijn EW niet stabiel makkelijk aggregeren
- Bij voorkeur: eukaryote gastheer = gist of hybridoma’s / welke Ab chassis.
o Ab (full length) van volledige lengte, chaperones nodig om te vouwen en
glycosylering voor functie: eukaryote gastheer kan beiden bieden.
o Chassis = Ab-ruggengraat (muis, chimeeer, gehumaniseerd en menselijk): centraal
onderdeel in fabricageproces beschrijven waaraan u nog onderdelen toevoegt.
Menselijk = minst immunogeen
Gehumaniseerd: minste aanpassingen of optimalisatie voor therapeutica.
Muis mAb: therapeutisch of diagnostisch
Immunogeniciteit van muis Ab verminderen:
o Fv overbrengen naar gehumaniseerde chassis chimeer Ab
o Alleen CDR-lussen, die direct contact maken met antigen,
overbrengen naar gehumaniseerde chassis.
IgG fragmenten
- Levensvatbaar biotherapeuticum zolang de antigen binding behouden blijft
- Geen volledige IgG nodig voor functie: zolang Fv behouden blijft en binding mogelijk is, kan
dit molecule gebruikt worden voor functie.
o Humaan Ab of gehumaniseerde chassis: 2 fragmenten/ketens voor een volledig Fv,
dus dAbs niet optimaal
Andere natuurlijke Ab-structuren
- Haaien-Ab en kameelachtigen-Ab: binden met hoge affiniteit vanuit een enkel domein (scFv).
o Top of IgG equivalent: geen dubbele keten voor binding maar singel domein capabel
voor het bereiken van de hoge affiniteit, hetzelfde een humaan Ab zou bereiken.
- Fragmenten daarvan kunnen ook gebruikt worden:
o Nanobodies = kameelachtig singel dAbs (kleiner dan scFv): VHH-domein.
,Biotechnologie Les 5: designing, purifying and understand antibodies
EW ontworpen voor binding
- Patroon voor succesvolle EW = lage immunogeniciteit.
- Patroon in hun ontwikkeling = gerichte evolutie
- Toepassingen gaan verder dan biotherapeutica
o Diagnostische reagentia = ELISA
o Biotechnologische toepassingen = EW-zuivering, verbeterde PCR
o Onderzoeksmiddelen = Ab-fluorescerende EW-fusies
o Bioremediatie = metaalbindende peptiden
, Biotechnologie Les 5: designing, purifying and understand antibodies
EW productie in andere gastheren
Relevante gastheren voor op grote schaal EW-expressie
Sterktes Limitaties
Prokaryoten - Makkelijk manipuleren (incl: - Minimale post-
- E. coli ontwikkelen) translatie modificatie
- Grote schaal fermentatie (PTM)
- Eenvoudige en goedkope grondstof - Laagste ondersteuning
- Hoge opbrengt (yield) voor EW-vorming
Gisten - Makkelijk manipuleren - PTM kan anders zijn
- Pichia pastoris - Grote schaal fermentatie bij de mens
- Hoge opbrengst
Mammalia cel - Alle PTM beschikbaar - Trage groei
- CHO = chinese - Kan groeien in suspensie - Moeilijk opschalen
hamster ovary - Duur
- Afhankelijk van serum
Vereisten voor EW-expressie in nieuwe gastheer
- Methode om gastheer te transformeren.
o Waar DNA in gastheer inbrengen is niet gegeven
Bacterie: geslachtsgebonden elektroporatie in staat om DNA in cel af te
geven inefficiënt voor complexere cellen owv celwanden = algen,
plantencellen.
- Geschikte vector: stabiel
o Plasmide (E. Coli): maar zijn niet allemaal stabiel
o Shuttle vector = plasmide dat groeit: bezit alles om te groeien in een andere gastheer
- Selectiemarkering
o Kan gebruikt worden in de gastheer die je transformeert
o Bij shuttle vector: werkt op origineel organisme en
bestemmingsorganisme.
- Bekende onderdelen (promotor, RBS, terminator)
pRS
= diverse en meest populaire familie van shuttle-plasmiden voor E. Coli en gist.
- Gist: shuttle vector = deel van sequentie voor replicatie van bacteriën en
ander deel van sequentie voor replicatie van gisten.
- Strategie om vectoren te creëeren waar je efficiënt in E. Coli kan werken en dan verplaatsen
naar productie streng (=gist).
