Genoom samenvatting: deel 2
DNA en RNA technieken
Hydrisatie
1. Denaturatie leidt tot enkelstrengs RNA of DNA.
2. Renaturatie leidt tot dubbelstrengs RNA met RNA/DNA en DNA met RNA/DNA.
3. Het binden van een primer/probe of oligo die kan binden op enkele streng.
PCR
Twee doelen van PCR zijn het selecteren van een gen en het amplificeren van een gen. De
primer maakt het mogelijk om een specifiek gen veel te delen. Het stuk DNA dat je krijgt
wordt bepaald door de forward en reverse primer. Het stukje dat je deelt kan max enkele
duizenden bp groot zijn. Bp staat voor base-paar.
Restrictie-enzym
Enzymen die vaak uit bacterien komen die een hele specifieke
knip kunnen maken op een specifieke DNA sequentie. Je kan
weten waar een restrictie enzym gaat knippen als je het hele
genoom kent.
Bij het knippen van een streng krijg je of een blunt end, dit
betekend dat het recht is geknipt en dat er dus geen losse
streng over blijft. Er kan ook een sticky end ontstaan, dit is een langer stukje DNA dat dan
nog uitsteekt. Dit kan worden gebruikt om twee strengen met dezelfde sticky ends aan
elkaar te plakken.
Een knip door een restrictie enzym wordt ook wel een digestie genoemd.
Gel elektroforese
Hierbij worden stukken DNA gescheiden op grote; DNA is negatief geladen en worden op
een plaat aangetrokken door een positieve elektrode. De kleine stukjes bewegen sneller
over de plaat en scheiden daardoor van de grotere onderdelen. Hierdoor krijg je
verschillende strepen op de plaat. Met een ladder kan de grote van de deeltjes bepaald
worden; de lader geeft een bepaalde streep die vertaald naar een bepaald dp.
Gel elektroforese is kankerverwekkend, want er moeten deeltjes aan het DNA gebonden
worden en dan onder UV-licht gehouden worden. Beide kunnen kanker verwekken.
Op het onderstaande plaatje is te zien hoe met een digestie er twee strepen zijn wanneer er
succesvol is geknipt en er dus twee kleinere DNA fragmenten aanwezig zijn die sneller
dalen dan de grotere fragmenten.
, Sanger sequencing
Bij Sanger sequecing wordt er op een enkelstreng DNA fragment aangebouwt met normale
nucleotide en ddNTP’s. de ddNTP’s voorkomen verdere groei van de streng waardoor na
denaturatie een korter stukje DNA overblijft. Op het ddNTP, die op het uiteinde van het korte
fragment is gebonden, zit ook een fleurescente stof die een kleur reflecteerd. Hierdoor kan
worden herkent welke van de vier (ATCG) nucleotide er op het uiteinde zit. Ook kan op een
gelelektroforese plaat de grote van het DNA bepaald worden. Hiermee kan dus worden
bepaald welke nucleotide op welke plaats bevindt.
1. Lange streng van gen met onbekende sequentie wordt opgelost met NTP’s en
ddNTP’s met de juiste geassocieerde kleur bij de juiste base.
2. De oplossing wordt met PCR gedeeld, waardoor DNA fragmenten van verschillende
groottes ontstaan met elk hun eigen gekleurde ddNTP’s op het uiteinde.
3. De deeltjes worden gescheiden op grote op een gelelektroforese plaat.
4. De deeltjes die te dichtbij de positieve elektrode komen vallen in een gat langs een
lazer waar de kleur van het deeltje wordt geregistreerd. Het eerste lichte dat ze zien
is de eerste base van het onbekende lange streng.
5. Dit gaat door tot dat alle fragmenten er langs zijn geweest en dus de hele sequentie
bekend is.
cDNA
mRNA wordt door reverse transcriptase en een poly-T-primer omgezet in een dubbele
streng met een RNA en een DNA zijde. Vervolgens wordt het RNA verwijderd door RNAse
H. Hierdoor blijft een enkele DNA streng over die vervolgens met DNA-polymerase kan
worden aangebouwd. Dit DNA heet cDNA, het is namelijk geen normaal DNA, want het bezit
geen intronen en heeft wel een poly-a-staart sequentie.
DNA en RNA technieken
Hydrisatie
1. Denaturatie leidt tot enkelstrengs RNA of DNA.
2. Renaturatie leidt tot dubbelstrengs RNA met RNA/DNA en DNA met RNA/DNA.
3. Het binden van een primer/probe of oligo die kan binden op enkele streng.
PCR
Twee doelen van PCR zijn het selecteren van een gen en het amplificeren van een gen. De
primer maakt het mogelijk om een specifiek gen veel te delen. Het stuk DNA dat je krijgt
wordt bepaald door de forward en reverse primer. Het stukje dat je deelt kan max enkele
duizenden bp groot zijn. Bp staat voor base-paar.
Restrictie-enzym
Enzymen die vaak uit bacterien komen die een hele specifieke
knip kunnen maken op een specifieke DNA sequentie. Je kan
weten waar een restrictie enzym gaat knippen als je het hele
genoom kent.
Bij het knippen van een streng krijg je of een blunt end, dit
betekend dat het recht is geknipt en dat er dus geen losse
streng over blijft. Er kan ook een sticky end ontstaan, dit is een langer stukje DNA dat dan
nog uitsteekt. Dit kan worden gebruikt om twee strengen met dezelfde sticky ends aan
elkaar te plakken.
Een knip door een restrictie enzym wordt ook wel een digestie genoemd.
Gel elektroforese
Hierbij worden stukken DNA gescheiden op grote; DNA is negatief geladen en worden op
een plaat aangetrokken door een positieve elektrode. De kleine stukjes bewegen sneller
over de plaat en scheiden daardoor van de grotere onderdelen. Hierdoor krijg je
verschillende strepen op de plaat. Met een ladder kan de grote van de deeltjes bepaald
worden; de lader geeft een bepaalde streep die vertaald naar een bepaald dp.
Gel elektroforese is kankerverwekkend, want er moeten deeltjes aan het DNA gebonden
worden en dan onder UV-licht gehouden worden. Beide kunnen kanker verwekken.
Op het onderstaande plaatje is te zien hoe met een digestie er twee strepen zijn wanneer er
succesvol is geknipt en er dus twee kleinere DNA fragmenten aanwezig zijn die sneller
dalen dan de grotere fragmenten.
, Sanger sequencing
Bij Sanger sequecing wordt er op een enkelstreng DNA fragment aangebouwt met normale
nucleotide en ddNTP’s. de ddNTP’s voorkomen verdere groei van de streng waardoor na
denaturatie een korter stukje DNA overblijft. Op het ddNTP, die op het uiteinde van het korte
fragment is gebonden, zit ook een fleurescente stof die een kleur reflecteerd. Hierdoor kan
worden herkent welke van de vier (ATCG) nucleotide er op het uiteinde zit. Ook kan op een
gelelektroforese plaat de grote van het DNA bepaald worden. Hiermee kan dus worden
bepaald welke nucleotide op welke plaats bevindt.
1. Lange streng van gen met onbekende sequentie wordt opgelost met NTP’s en
ddNTP’s met de juiste geassocieerde kleur bij de juiste base.
2. De oplossing wordt met PCR gedeeld, waardoor DNA fragmenten van verschillende
groottes ontstaan met elk hun eigen gekleurde ddNTP’s op het uiteinde.
3. De deeltjes worden gescheiden op grote op een gelelektroforese plaat.
4. De deeltjes die te dichtbij de positieve elektrode komen vallen in een gat langs een
lazer waar de kleur van het deeltje wordt geregistreerd. Het eerste lichte dat ze zien
is de eerste base van het onbekende lange streng.
5. Dit gaat door tot dat alle fragmenten er langs zijn geweest en dus de hele sequentie
bekend is.
cDNA
mRNA wordt door reverse transcriptase en een poly-T-primer omgezet in een dubbele
streng met een RNA en een DNA zijde. Vervolgens wordt het RNA verwijderd door RNAse
H. Hierdoor blijft een enkele DNA streng over die vervolgens met DNA-polymerase kan
worden aangebouwd. Dit DNA heet cDNA, het is namelijk geen normaal DNA, want het bezit
geen intronen en heeft wel een poly-a-staart sequentie.
