Duke Cohan Vragen
Wat is de rol van de preTCR?
De vroegste thymocyten missen CD4 en CD8 op hun membraan en worden ‘dubbel negatief’ genoemd. Die
dubbel negatieve thymocyten kunnen differentiëren volgens 2 wegen :
1. De meerderheid van de ‘dubbel negatieve‘ thymocyten gaat de keten herschikken en tot expressie
brengen in een pre-T-cel receptor (pre-TCR). Uiteindelijk rijpen deze cellen uit tot CD4+ T-cellen of
CD8+ T-cellen Het pre-TCR complex omvat een complex van de CD3 polypeptiden en een
heterodimeer bestaande uit de -keten van de TCR en een invariante pre-T 𝛼-keten.
2. Een klein percentage van de thymocyten gaat functionele TCR tot expressie brengen en ontwikkelen tot
dubbel negatieve (CD4-CD8-), CD3+, 𝛄𝛿 T-cellen.
Wat hebben preTCR en peptide-MHC (pMHC) met elkaar te maken?
The preTCR is proposed to not have an extracellular ligand. we show structurally and functionally that this is not
so. We show that if the preTCR isn’t activated by MHX interaction, strange things happen, including entering a
pro-oncogenic state. We show that TCR signalling is actually ‘mechanosensing’
And just in case people still don’t believe us that the preTCR needs to interact with MHC to support repertoire
development, we show incidence of highly unusual thymic tumours in mice lacking all MHC
- MHC class I is not a ligand for the preTCR
- In MHC-deficient mice (missing both Class I and Class II), no problem in progression to the DP stage, so
MHC is not a ligand for the preTCR
PreTCR, its expression leads to signaling via the cytoplasmic tyrosine kinase Lck and that this is crucial for the
further development of an αβ T cell
the preTCR ligand interaction with pMHC helps protect T cell development!
1
, Werkcollege vragen
1. Onderzoek de rol van een intracellulair peptidase eiwit DPP9 in pyroptosis van monocyten en
macrofagen
= Inflammatoir geprogrammeerde celdood. DPP9 speelt een rol bij de pyroptose, dit is een vorm van celdood
geassocieerd met inflammatie. Inflammatie start intracellulair, IL-1 en IL-8 spelen hierbij een rol.
Manier 1:
Stap 1: In vivo of In vitro? → Stel je kiest in vitro
Stap 2: Ga je primaire cellen of cellijnen gebruiken? → Stel je kiest cellijn*
Stap 3: Hoe kom je aan deze cellen? → Halen uit het bloed
Stap 4: Ga je deze halen uit bloed van muizen / mensen → Mensen
Stap 5a: Monocyten uit bloed isoleren door centrifugeren met ficol en percol als densiteitsgradiënt medium,
vervolgens krijg je bloed met verschillende lagen in densiteit. Er ontstaan dus meerdere lagen:
1. Plasma
2. PBMC = perifeer bloed met mononucleaire cellen, bevat monocyten, lymfocyten en NK-cellen
3. Rode bloedcellen, bevat ook polymorfe nucleaire cellen zoals granulocyten
* Je gaat primaire cellen uit bloed halen, deze breng je op een medium, cellen gaan delen en je haalt hier 1 specifieke
cel uit. Deze breng je op nieuw medium en ga je verder kweken --> Je hebt cellijn gemaakt
Uit het PBMC moet je de monocyten isoleren → Hoe?
( Uit het PBMC kun je Monocyten en/of lymfocyten cellen isoleren → Hoe? )
1. Positieve selectie → Met CD14 magnetische beads
a. Monocyten zijn CD14+ en zullen binden met de beads welke magnetisch zijn en zo geïsoleerd
kunnen worden
b. Lymfocyten zijn CD14- en zullen niet binden met de CD14 magnetische beads en worden
weggespoeld.
2. Negatieve selectie → Alle CD14- cellen labelen ( = lymfocyten)
a. Monocyten zijn CD14+ en zijn niet gelabeld en zullen worden weggespoeld
b. Lymfocyten zijn CD14- en zijn wel gelabeld, zullen in kolom blijven zitten
Stap 5b: Quality control via flow cytometrie analyse, je moet hier CD14+ cellen waarnemen, dit zijn de
monocyten.
Stap 6: De monocyten differentiëren tot macrofagen, door toevoegen van
1. M-CSF = Macrofaag colony stimulating factor
2. LPS = soort Pamp
3. IL-4
Stap 7: DPP9 eiwitten, aanwezig in monocyten en macrofagen, moeten kunnen worden waargenomen, hiervoor
ga je antilichamen labelen die op het eiwit kunnen binden. Verschillende label opties:
1. Enzymatisch
2. HRP = Horse Radish peroxidase uit mirkswortel
3. Fluorescentie labels
4. Biotine = streptavidin met fluorofoor of HRP aankoppelen
Deze labels worden gekoppeld aan een primair of secundair antilichaam, welke zullen binden op DPP9.
Stap 8:
- Via immunostaining kun je functies van DPP9 waarnemen, de cel wordt gefixeerd en er worden gaatjes
in de cel gemaakt waardoor de geconjugeerde antilichamen kunnen binden op de specifieke eiwitten, dit
kan worden waargenomen.
- Ook kan je via Western Blotting, waarvoor eerst SDS-page nodig is, antilichamen laten binden op het
DPP9 welke geconjugeerd zijn met een merker zoals HSP of fluorofoor.
2
Wat is de rol van de preTCR?
De vroegste thymocyten missen CD4 en CD8 op hun membraan en worden ‘dubbel negatief’ genoemd. Die
dubbel negatieve thymocyten kunnen differentiëren volgens 2 wegen :
1. De meerderheid van de ‘dubbel negatieve‘ thymocyten gaat de keten herschikken en tot expressie
brengen in een pre-T-cel receptor (pre-TCR). Uiteindelijk rijpen deze cellen uit tot CD4+ T-cellen of
CD8+ T-cellen Het pre-TCR complex omvat een complex van de CD3 polypeptiden en een
heterodimeer bestaande uit de -keten van de TCR en een invariante pre-T 𝛼-keten.
2. Een klein percentage van de thymocyten gaat functionele TCR tot expressie brengen en ontwikkelen tot
dubbel negatieve (CD4-CD8-), CD3+, 𝛄𝛿 T-cellen.
Wat hebben preTCR en peptide-MHC (pMHC) met elkaar te maken?
The preTCR is proposed to not have an extracellular ligand. we show structurally and functionally that this is not
so. We show that if the preTCR isn’t activated by MHX interaction, strange things happen, including entering a
pro-oncogenic state. We show that TCR signalling is actually ‘mechanosensing’
And just in case people still don’t believe us that the preTCR needs to interact with MHC to support repertoire
development, we show incidence of highly unusual thymic tumours in mice lacking all MHC
- MHC class I is not a ligand for the preTCR
- In MHC-deficient mice (missing both Class I and Class II), no problem in progression to the DP stage, so
MHC is not a ligand for the preTCR
PreTCR, its expression leads to signaling via the cytoplasmic tyrosine kinase Lck and that this is crucial for the
further development of an αβ T cell
the preTCR ligand interaction with pMHC helps protect T cell development!
1
, Werkcollege vragen
1. Onderzoek de rol van een intracellulair peptidase eiwit DPP9 in pyroptosis van monocyten en
macrofagen
= Inflammatoir geprogrammeerde celdood. DPP9 speelt een rol bij de pyroptose, dit is een vorm van celdood
geassocieerd met inflammatie. Inflammatie start intracellulair, IL-1 en IL-8 spelen hierbij een rol.
Manier 1:
Stap 1: In vivo of In vitro? → Stel je kiest in vitro
Stap 2: Ga je primaire cellen of cellijnen gebruiken? → Stel je kiest cellijn*
Stap 3: Hoe kom je aan deze cellen? → Halen uit het bloed
Stap 4: Ga je deze halen uit bloed van muizen / mensen → Mensen
Stap 5a: Monocyten uit bloed isoleren door centrifugeren met ficol en percol als densiteitsgradiënt medium,
vervolgens krijg je bloed met verschillende lagen in densiteit. Er ontstaan dus meerdere lagen:
1. Plasma
2. PBMC = perifeer bloed met mononucleaire cellen, bevat monocyten, lymfocyten en NK-cellen
3. Rode bloedcellen, bevat ook polymorfe nucleaire cellen zoals granulocyten
* Je gaat primaire cellen uit bloed halen, deze breng je op een medium, cellen gaan delen en je haalt hier 1 specifieke
cel uit. Deze breng je op nieuw medium en ga je verder kweken --> Je hebt cellijn gemaakt
Uit het PBMC moet je de monocyten isoleren → Hoe?
( Uit het PBMC kun je Monocyten en/of lymfocyten cellen isoleren → Hoe? )
1. Positieve selectie → Met CD14 magnetische beads
a. Monocyten zijn CD14+ en zullen binden met de beads welke magnetisch zijn en zo geïsoleerd
kunnen worden
b. Lymfocyten zijn CD14- en zullen niet binden met de CD14 magnetische beads en worden
weggespoeld.
2. Negatieve selectie → Alle CD14- cellen labelen ( = lymfocyten)
a. Monocyten zijn CD14+ en zijn niet gelabeld en zullen worden weggespoeld
b. Lymfocyten zijn CD14- en zijn wel gelabeld, zullen in kolom blijven zitten
Stap 5b: Quality control via flow cytometrie analyse, je moet hier CD14+ cellen waarnemen, dit zijn de
monocyten.
Stap 6: De monocyten differentiëren tot macrofagen, door toevoegen van
1. M-CSF = Macrofaag colony stimulating factor
2. LPS = soort Pamp
3. IL-4
Stap 7: DPP9 eiwitten, aanwezig in monocyten en macrofagen, moeten kunnen worden waargenomen, hiervoor
ga je antilichamen labelen die op het eiwit kunnen binden. Verschillende label opties:
1. Enzymatisch
2. HRP = Horse Radish peroxidase uit mirkswortel
3. Fluorescentie labels
4. Biotine = streptavidin met fluorofoor of HRP aankoppelen
Deze labels worden gekoppeld aan een primair of secundair antilichaam, welke zullen binden op DPP9.
Stap 8:
- Via immunostaining kun je functies van DPP9 waarnemen, de cel wordt gefixeerd en er worden gaatjes
in de cel gemaakt waardoor de geconjugeerde antilichamen kunnen binden op de specifieke eiwitten, dit
kan worden waargenomen.
- Ook kan je via Western Blotting, waarvoor eerst SDS-page nodig is, antilichamen laten binden op het
DPP9 welke geconjugeerd zijn met een merker zoals HSP of fluorofoor.
2
