Eerste werkcolleges
Primaire celcultuur = Van orgaan / bloed / weefsel haal je cellen, maak een suspensie en breng deze op
een medium met specifieke groeifactoren → Primaire celcultuur
- Voor- en nadelen : Leven kort, kunnen niet ongelimiteerd prolifereren
Cellijnen = ontstaan wanneer je primaire celcultuur gekweekt hebt, hiervan een specifieke cel isoleert en in
een nieuwe cultuur aanbrengt en deze verder gaat kweken, er ontstaan dan cellen uit deze ene specifieke
cel.
- Voor- en nadelen : Ongelimiteerde groei en ongelimiteerde proliferatie maar kunnen ander gedrag
vertonen
Stappenplannen voor onderzoek bedenken
Stap 1. Ga je in vivo of in vitro
*in vivo = getest op levend wezen . in vitro = in reageerbuis / petrischaal
➢ In vivo: bij mens of proefdieren?
○ bij proefdieren nog vragen welke species je gebruikt (bij immuno vaak muizen gebruikt)
➢ In vitro: primaire of (getransformeerde) cellijnen?
○ Primaire heeft korte levensduur (dus moeilijker),
■ kan je halen uit weefsel, bloed, beenmerg, deze in een cultuur brengen en laten
differentiëren tot de gewenste cellen.
○ Cellijn kan je langer houden maar het dedifferentieert zich en gedraagt zich niet hetzelfde als
oorspronkelijk
Stap 2: Als je in vitro kiest, hoe kom je aan deze cellen? → Uit het bloed, van proefdier of mens?
Cellen uit het bloed isoleren door centrifugeren met ficol en/of percol, dit is een densiteitsgradiënt
medium, vervolgens krijg je bloed met verschillende lagen in densiteit. Er ontstaan dus meerdere lagen:
1. Plasma
2. PBMC = perifeer bloed met mononucleaire cellen, bevat monocyten, lymfocyten en NK-cellen
3. Rode bloedcellen, bevat ook polymorfe nucleaire granulocyten
Soort witte bloedcellen Onderverdeling Sub onderverdeling Sub Sub onderverdeling
(= Leukocyt)
Polymorf nucleaire granulocyten Eosinofiel
Kern bestaat uit verschillende lobben, Neutrofiel
veel granules in cytoplasma
Basofiel
Mononucleaire cellen Monocyten Differentiëren tot CD14 op membraan
macrofagen → CD14+
Geen aparte lobben, relatief weinig
granules Lymfocyten B-lymfocyten CD13
Worden vaak uit bloed geïsoleerd T-lymfocyten CD4+ T-helpercellen
CD8+ Cytotoxische T-cellen
Regulerende T-cellen
Uit Rode bloedcellen laagje kun je polymorfe nucleaire granulocyten isoleren.
1
,Stap 3: Meestal verder werken met PBMC
Uit het PBMC kun je Monocyten en/of lymfocyten cellen isoleren → Hoe?
1. Positieve selectie → Met CD14 magnetische beads
a. Monocyten zijn CD14+ en zullen binden met de beads welke magnetisch zijn en zo geïsoleerd
kunnen worden
b. Lymfocyten zijn CD14- en zullen niet binden met de CD14 magnetische beads en worden
weggespoeld.
2. Negatieve selectie → Alle CD14- cellen labelen ( = lymfocyten)
a. Monocyten zijn CD14+ en zijn niet gelabeld en zullen worden weggespoeld
b. Lymfocyten zijn CD14- en zijn wel gelabeld, zullen in kolom blijven zitten
Stap 4: Flow cytometrie analyse voor quality control,
1. Als je monocyten isoleert → CD14+ cellen waarnemen
2. Als je lymfocyten isoleert → CD14- cellen waarnemen
a. Van Lymfocyten heb je 2 soorten: B- en T-cellen
Stap 5: Differentiatie van monocyten naar macrofagen
1. Monocyten differentiëren tot macrofagen voor toevoegen van:
a. M-CSF = Macrofaag colony stimulating factor
b. LPS = soort Pamp
c. IL-4
Stap 6: Eiwitten aanwezig in de cellen moeten via antilichamen gelabeld worden om ze te kunnen
waarnemen. dit kan met bijv:
- Enzymatisch
- HRP = Horse Radish peroxidase uit mirkswortel + Luminol → Kleurreactie
- Fluorescentie labels → FITC / PE
- Biotine = streptavidin met fluorofoor of HRP aankoppelen
Let op antilichamen kunnen niet doordringen in cellen, 2 manieren om Ig toch te binden met specifiek eiwit
1. Cel fixeren en daarna gaatjes in maken waar de Ig’s doorheen kunnen dringen
2. Cel lysis en eiwit mensen via SDS page scheiden
Stap 6: Met welke techniek kan je aantonen of eiwit er in zit?
➢ immunoprecipitatie => maar dit vooral gebruiken voor Ag-AL interactie! niet echt om een eiwit te
lokaliseren
➢ immunofluorescentie en fluorescentiemicroscoop => maar er zijn geen DPP9 antilichamen
beschikbaar
➢ flowcytometrie => wat is voordeel boven immunofluorescentie? je kan ook andere eigenschappen
aantonen of parameters analyseren => makkelijkste toepassing is wnr we het over fenotypering:
opp-antigenen gebruiken => makkelijk detecteerbaar. voor intracellulaire goede protocol hebben =>
dus intracellulaire eiwitten niet gemakkelijkste om te onderzoeken
➢ subcellulaire fractionatie => waar vindt je die DPP9 juist => zo kan je organellen scheiden => maar
hoe aantonen in welk organel het zit?
➢ soms kijken op mRNA niveau => PCR doen => maar geen goede verdeling mRNA en expressie
eiwit
➢ western blotting is juist => SDS-PAGE gescheiden eiwitten blotten op nitrocellulose membraan en
dan overgebleven plaatsen blokkeren en dan incuberen met primair antilichaam en dan secundair AL
=> die principe van 1e en 2e antilichaam => welke labels worden geplaatst aan 2e AL? HRP,
biotine… allemaal goed. zie tekening boven.
probleem: eiwitten zijn gedenatureerd bij SDS-PAGE => andere AL nodig dat ertegen bindt => AL moet in
staat zijn om te binden aan gedenatureerd eiwit bij western blotting!
=> in fluorescentiemicroscopie natieve epitopen nog intact zijn en meer kans om ze te zien
2
, Laatste Werkcollege over gebruik van antilichamen
Introductie
https://www.youtube.com/watch?v=qQ0BaZ83ZtY&list=PLvNqhjdXI8IFL-CwXs8qQNoB_CiHTBDcm
Waarom zijn antilichamen belangrijk
➢ Fysiologisch belang = Staan als deel van het aangeboren immuunsysteem in tegen de verdediging
pathogenen
➢ Diagnostisch belang = Concentraties in het bloed bepalen om bijv na te gaan of een vaccin gewerkt
heeft, of bijv te weten kunnen komen of iemand een specifieke aandoening heeft gehad
Zonder stimulus zit een antilichaam op het membraan van een B-cel. Wanneer een immuunrespons wordt
uitgelokt, ondergaat het antilichaam een aantal veranderingen:
1. Affiniteitsmaturatie van antilichaam
Antilichaam gaat het antigen beter herkennen en sterker kunnen binden
2. Antilichamen gaan gesecreteerd worden door de B-cel
3. Antilichaam ondergaat een isotype switch
Hierdoor krijgen de antilichamen andere effector functies
Klassen van antilichamen
1. IgA
2. IgM
3. IgG
4. IgD
5. IgE
IgG antilichamen
➢ Deze klasse bevat 4 subklassen; IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
➢ Deze subklassen verschillen in locatie en aantal(len) van disulfidebruggen.
➢ Alle subklassen kunnen binden met FC-receptoren van fagocyten (zoals macrofagen)
Interacties tussen antigen-antilichaam
Antilichaam-antigenen worden niet-covalent aan elkaar gebonden, deze bindingen zijn relatief zwak.
Niet covalente interacties:
- H-brug
- Ionische binding
- Hydrofobe interacties
- Van der Waals krachten
De scharnier regio, ofwel de hinge regio, van het antilichaam zorgt voor enige flexibiliteit in de binding met
hun antilichaam.
3
Primaire celcultuur = Van orgaan / bloed / weefsel haal je cellen, maak een suspensie en breng deze op
een medium met specifieke groeifactoren → Primaire celcultuur
- Voor- en nadelen : Leven kort, kunnen niet ongelimiteerd prolifereren
Cellijnen = ontstaan wanneer je primaire celcultuur gekweekt hebt, hiervan een specifieke cel isoleert en in
een nieuwe cultuur aanbrengt en deze verder gaat kweken, er ontstaan dan cellen uit deze ene specifieke
cel.
- Voor- en nadelen : Ongelimiteerde groei en ongelimiteerde proliferatie maar kunnen ander gedrag
vertonen
Stappenplannen voor onderzoek bedenken
Stap 1. Ga je in vivo of in vitro
*in vivo = getest op levend wezen . in vitro = in reageerbuis / petrischaal
➢ In vivo: bij mens of proefdieren?
○ bij proefdieren nog vragen welke species je gebruikt (bij immuno vaak muizen gebruikt)
➢ In vitro: primaire of (getransformeerde) cellijnen?
○ Primaire heeft korte levensduur (dus moeilijker),
■ kan je halen uit weefsel, bloed, beenmerg, deze in een cultuur brengen en laten
differentiëren tot de gewenste cellen.
○ Cellijn kan je langer houden maar het dedifferentieert zich en gedraagt zich niet hetzelfde als
oorspronkelijk
Stap 2: Als je in vitro kiest, hoe kom je aan deze cellen? → Uit het bloed, van proefdier of mens?
Cellen uit het bloed isoleren door centrifugeren met ficol en/of percol, dit is een densiteitsgradiënt
medium, vervolgens krijg je bloed met verschillende lagen in densiteit. Er ontstaan dus meerdere lagen:
1. Plasma
2. PBMC = perifeer bloed met mononucleaire cellen, bevat monocyten, lymfocyten en NK-cellen
3. Rode bloedcellen, bevat ook polymorfe nucleaire granulocyten
Soort witte bloedcellen Onderverdeling Sub onderverdeling Sub Sub onderverdeling
(= Leukocyt)
Polymorf nucleaire granulocyten Eosinofiel
Kern bestaat uit verschillende lobben, Neutrofiel
veel granules in cytoplasma
Basofiel
Mononucleaire cellen Monocyten Differentiëren tot CD14 op membraan
macrofagen → CD14+
Geen aparte lobben, relatief weinig
granules Lymfocyten B-lymfocyten CD13
Worden vaak uit bloed geïsoleerd T-lymfocyten CD4+ T-helpercellen
CD8+ Cytotoxische T-cellen
Regulerende T-cellen
Uit Rode bloedcellen laagje kun je polymorfe nucleaire granulocyten isoleren.
1
,Stap 3: Meestal verder werken met PBMC
Uit het PBMC kun je Monocyten en/of lymfocyten cellen isoleren → Hoe?
1. Positieve selectie → Met CD14 magnetische beads
a. Monocyten zijn CD14+ en zullen binden met de beads welke magnetisch zijn en zo geïsoleerd
kunnen worden
b. Lymfocyten zijn CD14- en zullen niet binden met de CD14 magnetische beads en worden
weggespoeld.
2. Negatieve selectie → Alle CD14- cellen labelen ( = lymfocyten)
a. Monocyten zijn CD14+ en zijn niet gelabeld en zullen worden weggespoeld
b. Lymfocyten zijn CD14- en zijn wel gelabeld, zullen in kolom blijven zitten
Stap 4: Flow cytometrie analyse voor quality control,
1. Als je monocyten isoleert → CD14+ cellen waarnemen
2. Als je lymfocyten isoleert → CD14- cellen waarnemen
a. Van Lymfocyten heb je 2 soorten: B- en T-cellen
Stap 5: Differentiatie van monocyten naar macrofagen
1. Monocyten differentiëren tot macrofagen voor toevoegen van:
a. M-CSF = Macrofaag colony stimulating factor
b. LPS = soort Pamp
c. IL-4
Stap 6: Eiwitten aanwezig in de cellen moeten via antilichamen gelabeld worden om ze te kunnen
waarnemen. dit kan met bijv:
- Enzymatisch
- HRP = Horse Radish peroxidase uit mirkswortel + Luminol → Kleurreactie
- Fluorescentie labels → FITC / PE
- Biotine = streptavidin met fluorofoor of HRP aankoppelen
Let op antilichamen kunnen niet doordringen in cellen, 2 manieren om Ig toch te binden met specifiek eiwit
1. Cel fixeren en daarna gaatjes in maken waar de Ig’s doorheen kunnen dringen
2. Cel lysis en eiwit mensen via SDS page scheiden
Stap 6: Met welke techniek kan je aantonen of eiwit er in zit?
➢ immunoprecipitatie => maar dit vooral gebruiken voor Ag-AL interactie! niet echt om een eiwit te
lokaliseren
➢ immunofluorescentie en fluorescentiemicroscoop => maar er zijn geen DPP9 antilichamen
beschikbaar
➢ flowcytometrie => wat is voordeel boven immunofluorescentie? je kan ook andere eigenschappen
aantonen of parameters analyseren => makkelijkste toepassing is wnr we het over fenotypering:
opp-antigenen gebruiken => makkelijk detecteerbaar. voor intracellulaire goede protocol hebben =>
dus intracellulaire eiwitten niet gemakkelijkste om te onderzoeken
➢ subcellulaire fractionatie => waar vindt je die DPP9 juist => zo kan je organellen scheiden => maar
hoe aantonen in welk organel het zit?
➢ soms kijken op mRNA niveau => PCR doen => maar geen goede verdeling mRNA en expressie
eiwit
➢ western blotting is juist => SDS-PAGE gescheiden eiwitten blotten op nitrocellulose membraan en
dan overgebleven plaatsen blokkeren en dan incuberen met primair antilichaam en dan secundair AL
=> die principe van 1e en 2e antilichaam => welke labels worden geplaatst aan 2e AL? HRP,
biotine… allemaal goed. zie tekening boven.
probleem: eiwitten zijn gedenatureerd bij SDS-PAGE => andere AL nodig dat ertegen bindt => AL moet in
staat zijn om te binden aan gedenatureerd eiwit bij western blotting!
=> in fluorescentiemicroscopie natieve epitopen nog intact zijn en meer kans om ze te zien
2
, Laatste Werkcollege over gebruik van antilichamen
Introductie
https://www.youtube.com/watch?v=qQ0BaZ83ZtY&list=PLvNqhjdXI8IFL-CwXs8qQNoB_CiHTBDcm
Waarom zijn antilichamen belangrijk
➢ Fysiologisch belang = Staan als deel van het aangeboren immuunsysteem in tegen de verdediging
pathogenen
➢ Diagnostisch belang = Concentraties in het bloed bepalen om bijv na te gaan of een vaccin gewerkt
heeft, of bijv te weten kunnen komen of iemand een specifieke aandoening heeft gehad
Zonder stimulus zit een antilichaam op het membraan van een B-cel. Wanneer een immuunrespons wordt
uitgelokt, ondergaat het antilichaam een aantal veranderingen:
1. Affiniteitsmaturatie van antilichaam
Antilichaam gaat het antigen beter herkennen en sterker kunnen binden
2. Antilichamen gaan gesecreteerd worden door de B-cel
3. Antilichaam ondergaat een isotype switch
Hierdoor krijgen de antilichamen andere effector functies
Klassen van antilichamen
1. IgA
2. IgM
3. IgG
4. IgD
5. IgE
IgG antilichamen
➢ Deze klasse bevat 4 subklassen; IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
➢ Deze subklassen verschillen in locatie en aantal(len) van disulfidebruggen.
➢ Alle subklassen kunnen binden met FC-receptoren van fagocyten (zoals macrofagen)
Interacties tussen antigen-antilichaam
Antilichaam-antigenen worden niet-covalent aan elkaar gebonden, deze bindingen zijn relatief zwak.
Niet covalente interacties:
- H-brug
- Ionische binding
- Hydrofobe interacties
- Van der Waals krachten
De scharnier regio, ofwel de hinge regio, van het antilichaam zorgt voor enige flexibiliteit in de binding met
hun antilichaam.
3
