VERGELIJKEN CONCENTRATIE GEKEND EIWIT
1. Homogenisatie van weefsel
Weefsel aanbrengen in een buffer (vloeistof met bepaalde pH en bepaalde zouten) en
fijn maken met een stamper. Het zal dan in suspensie zijn.
2. Bepalen totale eiwitconcentratie in beide stalen
Spectrofotometrie: we laten licht van een bepaalde golflengte
invallen op een cuvette (buis met oplossing waarin de stof
waarvan we de concentratie willen kennen aanwezig is), het
licht dat uit de cuvette komt langs de andere kant zal een lagere
intensiteit hebben en het toestel meet hoeveel licht erdoor
komt (aan de hand van de lichtabsorptie (wet van Lambert-
Beer))
Bradford assay: Commassiebrilliant blue (bruin) reageert met basische en aromatische
aminozuren en kleurt blauw. Deze kleur kunnen we meten bij golflengte 585 nm. We maken een
concentratiereeks met gekende eiwitconcentraties en kijken met welke absorbantie de
onbekende staal overeenkomt en via lineaire regressie kunnen we de concentratie van ons
originele mengsel afleiden.
Lowry assay: peptidebinding reageert met koper en kleurt blauw
, 3. Detectie specifiek eiwit met antistof
Aangezien eiwitten kleurloos zijn, moeten we ze merken met iets (enzym dat een substraat omzet in
bv. neerslag, fluorescente stof of radioactieve stof) opdat we het eiwit gemakkelijk kunnen zien.
Western blot:
1) Scheiding van de eiwitten volgens grootte
PAGE (polyacrylamide gel elektroforese): we laten het mengsel
onder invloed van een elektrisch veld door een gel migreren
1. Denaturatie van eiwitten (staal opkoken en doorbreken
van zwavelbruggen (mercaptoethanol)
2. Binden aan SDS wat ervoor zal zorgen dat ze enkel op
basis van grootte en niet op lading worden
onderscheiden door hun een gelijkaardige vorm en lading
te geven
3. Eiwitmengsel met gekende concentratie (dat door SDS
omgeven is door negatieve lading) in laantjes in de
polyacrylamide gel aanbrengen (zelfde hoeveelheid
eiwitten: 30 µg) in het apparaat
4. Buffer aanbrengen in bovenste en onderste bakje
5. Aanbrengen ladingsveld
6. Eiwitten omgeven door negatieve lading migreren door
de gel naar positieve pool (kleinere sneller dan grotere)
7. Gel kleuren met commasassiebrilliant blue
8. Eiwitten van de gel over naar een membraan dat de nog steeds negatief geladen
eiwitten goed kan binden
1. Homogenisatie van weefsel
Weefsel aanbrengen in een buffer (vloeistof met bepaalde pH en bepaalde zouten) en
fijn maken met een stamper. Het zal dan in suspensie zijn.
2. Bepalen totale eiwitconcentratie in beide stalen
Spectrofotometrie: we laten licht van een bepaalde golflengte
invallen op een cuvette (buis met oplossing waarin de stof
waarvan we de concentratie willen kennen aanwezig is), het
licht dat uit de cuvette komt langs de andere kant zal een lagere
intensiteit hebben en het toestel meet hoeveel licht erdoor
komt (aan de hand van de lichtabsorptie (wet van Lambert-
Beer))
Bradford assay: Commassiebrilliant blue (bruin) reageert met basische en aromatische
aminozuren en kleurt blauw. Deze kleur kunnen we meten bij golflengte 585 nm. We maken een
concentratiereeks met gekende eiwitconcentraties en kijken met welke absorbantie de
onbekende staal overeenkomt en via lineaire regressie kunnen we de concentratie van ons
originele mengsel afleiden.
Lowry assay: peptidebinding reageert met koper en kleurt blauw
, 3. Detectie specifiek eiwit met antistof
Aangezien eiwitten kleurloos zijn, moeten we ze merken met iets (enzym dat een substraat omzet in
bv. neerslag, fluorescente stof of radioactieve stof) opdat we het eiwit gemakkelijk kunnen zien.
Western blot:
1) Scheiding van de eiwitten volgens grootte
PAGE (polyacrylamide gel elektroforese): we laten het mengsel
onder invloed van een elektrisch veld door een gel migreren
1. Denaturatie van eiwitten (staal opkoken en doorbreken
van zwavelbruggen (mercaptoethanol)
2. Binden aan SDS wat ervoor zal zorgen dat ze enkel op
basis van grootte en niet op lading worden
onderscheiden door hun een gelijkaardige vorm en lading
te geven
3. Eiwitmengsel met gekende concentratie (dat door SDS
omgeven is door negatieve lading) in laantjes in de
polyacrylamide gel aanbrengen (zelfde hoeveelheid
eiwitten: 30 µg) in het apparaat
4. Buffer aanbrengen in bovenste en onderste bakje
5. Aanbrengen ladingsveld
6. Eiwitten omgeven door negatieve lading migreren door
de gel naar positieve pool (kleinere sneller dan grotere)
7. Gel kleuren met commasassiebrilliant blue
8. Eiwitten van de gel over naar een membraan dat de nog steeds negatief geladen
eiwitten goed kan binden
