Moleculaire Biologie
Les1
De structuren van DNA en RNA kunnen onderscheiden en beschrijven (WC1)
DNA
• Fosfodiesterbindingen tussen fosfaatgroepen en pentoses
• 5’ uiteinde heeft een fosfaatgroep
• 3’uiteinde heeft een OH-groep
• Schrijfwijze van DNA-sequenties altijd van 5’ naar 3’
• De strengen zijn antiparallel aan elkaar
• Buitenzijde = fosfaat-pentose backbone
• Binnenzijde = stikstofbasen
• Basenparing met H-bruggen
• De strengen zijn complementair
• A=T
• C≡G
• deoxyribose
Chargaff’s rules
• dsDNA altijd A=T en C≡G
• Purines A en G
• Pyrimidines: C, T en U
RNA
• T (thymine) wordt vervangen door U (uracil)
• Ribose
• Enkelstrengs
• 5’ uiteinde heeft een fosfaatgroep
• 3’uiteinde heeft een OH-groep
Ribonucleotiden en deoxyribonucleotiden
A = adenosine T = thymidine U = uridine
C = cytidine G = guanosine
M = mono D = di T = tri
P = fosfaat d = deoxy
Voorbeeld: GDP = guanosinedifosfaat dATP = deoxyadenosinetrifosfaat
1
,De PCR-techniek en gevolgen van wijzigingen in het protocol kunnen uitleggen (WC1)
PCR, polymerase chain reaction, is een methode om een specifiek stuk DNA te amplificeren
met behulp van DNA-polymerase. DNA polymerasen hebben primers nodig, primers.
De PCR wordt in de praktijk gebruikt voor bv. Forensisch onderzoek of genetische testen.
reactiemix PCR:
• DNA met target sequentie
• Primerpaar: vertellen de DNA-polymerase waar ze moeten starten met kopiëren
• DNA-polymerase: herkent dsDNA waar er een vrije 3’nucleotide is, gaat hieraan binden
en beweegt, door telkens nucleotiden toe te voegen, naar de 5’ kant
• Nucleotiden (dNTP’s)
• Reactiebuffer (zorgt ervoor dat de pH op de goede plek zit) (Mg)
De PCR-methode bestaat uit 3 stappen:
1) Denaturation: 94˚C
De temperatuur wordt verhoogd waardoor het dsDNA splitst in 2 losse strengen
Duurt 30 sec – 2 minuten
2) Annealing: 50-60˚C
Temperatuur wordt verlaagd zodat de primers kunnen binden aan het specifieke deel
Duurt 30 seconde
3) Elongation: 72˚C
De temperatuur wordt weer verhoogd naar temperatuur waarbij DNA-polymerase werkt
en weer nieuwe nucleotiden kan binden
Tijd afhankelijk aan hoe lang het stuk je dat gerepliceerd wordt (1000 bp = 1 minuut)
Problemen die kunnen voorkomen:
• Te lage annealingstemperatuur: er binden te veel primers, veel verschillende stukjes,
meer bandjes op de gel
• Te hoge annealingstemperatuur: te weinig primers binden, geen eindproduct
• Te korte elongatie: het eindproduct wordt te kort
Goed om te weten:
• Primers kunnen niet hergebruikt worden. De primer blijft onderdeel van het stuk
gesynthetiseerde DNA
• Het gewenste deel is pas bij de 3e cyclus, daarvoor is er wel al een kopie maar deze is
langer dan gewenst
• De primers denatureren niet bij de elongatiestap door DNA-polymerase. DNA-
polymerase bindt en stabiliseert daardoor de primers
• Taq-polymerase wordt vaak gebruikt omdat ze veel sneller zijn en tegen hoge
temperaturen kan
2
,Primers kunnen ontwerpen en de zaken waar rekening mee gehouden moet worden
kunnen uitleggen (WC1)
Een primer is stukje RNA waardoor er ds RNA/DNA is. Doordat het dubbelstrengs is kan
DNA-polymerase binden en starten. In menselijk lichaam zijn de primers van RNA, in het lab
zijn de primers van DNA
De smelttemperatuur hangt af van de primer (hoeveelheid AT en CG), de smelttemperatuur is
goed wanneer de primer loslaat van het template. De annealingstemperatuur zit altijd 5˚C
eronder.
Richtlijnen primers
1) De lengte ligt tussen de 17 en 28 nucleotiden
o Langer à annealing wordt moelijker
o Korter à minder specificiteit
2) Het GC-gehalte ligt tussen de 50 en 60%
o Hoger à te hoge smelttemperatuur
o Lager à minder specificiteit
3) Forward en reverse primers moeten ongeveer dezelfde smelttemperatuur hebben (5˚C)
4) Primers moeten aan 3’ zijde eindigen op G of C (voorkomt loslaten)
5) Niet meer dan 3 C’s of G’s aan 3’ uiteinde, primer kan anders te makkelijk binden aan
(verkeerde) G/C tijde gebieden in het target
6) Er mag geen baseparing mogelijk zijn in de primer zelf (self-annealing) of tussen twee
primers (primer dimer)
3
, CFTR (taaislijmziekte)
CFTR is een eiwit op het membraan die actief Cl naar buiten pompt. Dit eiwit zit op het
membraan in de longen, door dit eiwit blijven de longblaasjes nat. De longblaasjes bevatten
slijm en kunnen op deze manier bacteriën/virussen/stofdeeltjes weghalen.
Bij een gemuteerd CFTR-eiwit is er geen actief transport van Cl meer. Hierdoor is er geen
fysieke barrière meer, dus gevoelig voor infecties. Een gemuteerd CFTR-eiwit is autosomaal
recessief. Er zijn verschillende soorten mutaties:
• Eiwit werkt wel maar is niet sterk
• Minder transcriptie dus minder eiwitten
• Geen translatie tot eiwit
• Translatie tot eiwit maar kan geen Cl transporteren
4
Les1
De structuren van DNA en RNA kunnen onderscheiden en beschrijven (WC1)
DNA
• Fosfodiesterbindingen tussen fosfaatgroepen en pentoses
• 5’ uiteinde heeft een fosfaatgroep
• 3’uiteinde heeft een OH-groep
• Schrijfwijze van DNA-sequenties altijd van 5’ naar 3’
• De strengen zijn antiparallel aan elkaar
• Buitenzijde = fosfaat-pentose backbone
• Binnenzijde = stikstofbasen
• Basenparing met H-bruggen
• De strengen zijn complementair
• A=T
• C≡G
• deoxyribose
Chargaff’s rules
• dsDNA altijd A=T en C≡G
• Purines A en G
• Pyrimidines: C, T en U
RNA
• T (thymine) wordt vervangen door U (uracil)
• Ribose
• Enkelstrengs
• 5’ uiteinde heeft een fosfaatgroep
• 3’uiteinde heeft een OH-groep
Ribonucleotiden en deoxyribonucleotiden
A = adenosine T = thymidine U = uridine
C = cytidine G = guanosine
M = mono D = di T = tri
P = fosfaat d = deoxy
Voorbeeld: GDP = guanosinedifosfaat dATP = deoxyadenosinetrifosfaat
1
,De PCR-techniek en gevolgen van wijzigingen in het protocol kunnen uitleggen (WC1)
PCR, polymerase chain reaction, is een methode om een specifiek stuk DNA te amplificeren
met behulp van DNA-polymerase. DNA polymerasen hebben primers nodig, primers.
De PCR wordt in de praktijk gebruikt voor bv. Forensisch onderzoek of genetische testen.
reactiemix PCR:
• DNA met target sequentie
• Primerpaar: vertellen de DNA-polymerase waar ze moeten starten met kopiëren
• DNA-polymerase: herkent dsDNA waar er een vrije 3’nucleotide is, gaat hieraan binden
en beweegt, door telkens nucleotiden toe te voegen, naar de 5’ kant
• Nucleotiden (dNTP’s)
• Reactiebuffer (zorgt ervoor dat de pH op de goede plek zit) (Mg)
De PCR-methode bestaat uit 3 stappen:
1) Denaturation: 94˚C
De temperatuur wordt verhoogd waardoor het dsDNA splitst in 2 losse strengen
Duurt 30 sec – 2 minuten
2) Annealing: 50-60˚C
Temperatuur wordt verlaagd zodat de primers kunnen binden aan het specifieke deel
Duurt 30 seconde
3) Elongation: 72˚C
De temperatuur wordt weer verhoogd naar temperatuur waarbij DNA-polymerase werkt
en weer nieuwe nucleotiden kan binden
Tijd afhankelijk aan hoe lang het stuk je dat gerepliceerd wordt (1000 bp = 1 minuut)
Problemen die kunnen voorkomen:
• Te lage annealingstemperatuur: er binden te veel primers, veel verschillende stukjes,
meer bandjes op de gel
• Te hoge annealingstemperatuur: te weinig primers binden, geen eindproduct
• Te korte elongatie: het eindproduct wordt te kort
Goed om te weten:
• Primers kunnen niet hergebruikt worden. De primer blijft onderdeel van het stuk
gesynthetiseerde DNA
• Het gewenste deel is pas bij de 3e cyclus, daarvoor is er wel al een kopie maar deze is
langer dan gewenst
• De primers denatureren niet bij de elongatiestap door DNA-polymerase. DNA-
polymerase bindt en stabiliseert daardoor de primers
• Taq-polymerase wordt vaak gebruikt omdat ze veel sneller zijn en tegen hoge
temperaturen kan
2
,Primers kunnen ontwerpen en de zaken waar rekening mee gehouden moet worden
kunnen uitleggen (WC1)
Een primer is stukje RNA waardoor er ds RNA/DNA is. Doordat het dubbelstrengs is kan
DNA-polymerase binden en starten. In menselijk lichaam zijn de primers van RNA, in het lab
zijn de primers van DNA
De smelttemperatuur hangt af van de primer (hoeveelheid AT en CG), de smelttemperatuur is
goed wanneer de primer loslaat van het template. De annealingstemperatuur zit altijd 5˚C
eronder.
Richtlijnen primers
1) De lengte ligt tussen de 17 en 28 nucleotiden
o Langer à annealing wordt moelijker
o Korter à minder specificiteit
2) Het GC-gehalte ligt tussen de 50 en 60%
o Hoger à te hoge smelttemperatuur
o Lager à minder specificiteit
3) Forward en reverse primers moeten ongeveer dezelfde smelttemperatuur hebben (5˚C)
4) Primers moeten aan 3’ zijde eindigen op G of C (voorkomt loslaten)
5) Niet meer dan 3 C’s of G’s aan 3’ uiteinde, primer kan anders te makkelijk binden aan
(verkeerde) G/C tijde gebieden in het target
6) Er mag geen baseparing mogelijk zijn in de primer zelf (self-annealing) of tussen twee
primers (primer dimer)
3
, CFTR (taaislijmziekte)
CFTR is een eiwit op het membraan die actief Cl naar buiten pompt. Dit eiwit zit op het
membraan in de longen, door dit eiwit blijven de longblaasjes nat. De longblaasjes bevatten
slijm en kunnen op deze manier bacteriën/virussen/stofdeeltjes weghalen.
Bij een gemuteerd CFTR-eiwit is er geen actief transport van Cl meer. Hierdoor is er geen
fysieke barrière meer, dus gevoelig voor infecties. Een gemuteerd CFTR-eiwit is autosomaal
recessief. Er zijn verschillende soorten mutaties:
• Eiwit werkt wel maar is niet sterk
• Minder transcriptie dus minder eiwitten
• Geen translatie tot eiwit
• Translatie tot eiwit maar kan geen Cl transporteren
4
