H1 – Inleiding
Analytische biochemie
• Analytische chemie: het identificeren van componenten en samenstellingen van oplossingen
o Fundamentele eigenschappen van het analyte: vorm, lading en grootte
o Type analyse: scheiding, identificatie en quantificatie
• Biochemie: studie van chemische componenten en reacties die optreden in levende
organismen
• In vivo: proces dat in het levend organisme plaatsvindt
• In vitro: proces dat in het labo plaatsvindt
Cel-fractionering en cultiveren
• Cellen isoleren → primaire cultuur die niet kan veranderen
• Voordeel: je kan die primaire cultuur steeds gebruiken voor in vitro experimenten, zonder
dat je een levend organisme nodig hebt waaruit je steeds cellen moet halen
• Nadeel: in vitro experimenten wijken soms af van in vivo experimenten
Het pH-concept
• pH is een maateenheid voor de concentratie 𝐻 + ionen in een oplossing
• Bij neutrale pH (= 7) → [𝐻 + ] = [𝑂𝐻 − ] = 10−7 𝑀 → lading van water = 0 als de pH = 7
o Dit is het geval bij 25°C
o Bij 100°C → pH = 6, maar toch is water nog altijd neutraal, verklaring:
▪ Als de T stijgt → moleculen worden dynamischer → evenwichtsconstante
van water verandert (er gaat meer water splitsen in 𝐻 + en 𝑂𝐻 − )
▪ Meer 𝐻 + betekent dat de pH afneemt, maar er wordt evenveel extra 𝑂𝐻 −
geproduceerd → de lading blijft neutraal, terwijl de pH daalt
• 𝑝𝐾𝑎 is de pH-waarde waarbij een biomolecule een gelijke concentratie heeft van zijn
geprotoneerde en gedeprotoneerde vorm
1
,Algemene principes
Voorbereiding
• Stockoplossingen:
o De stock is altijd 10-100-1000x de werkconcentratie
o In maatcilinder: altijd onder de meniscus aflezen
o Bereid de stock altijd op dezelfde pH als het geplande experiment (bij verschillende
pH kunnen bepaalde eiwitten worden uitgeschakeld)
o Bereid de stock altijd op dezelfde T als het geplande experiment (want de pH is T-
afhankelijk)
o Voeg geen onnodige ionen toe, anders ontstaan er ongewenste reactieproducten
(het is dus niet handig om de pH via deze manier op het gewenste niveau te krijgen)
• Verdunningen:
o ¼ verdunning = 1 deel in 3 delen solute
o Niet te veel verdunnen → anders wordt de fout door de pipet te
groot
Protocols
Detectie van componenten in oplossing (zonder opzuivering)
• Gebeurt via een scala aan assays
• Benedict assay: verkleuring wijst op vrije suikers (dus geen genetisch
materiaal)
• Bial’s orcinol test: verkleuring wijst op pentose-suiker → er is genetisch
materiaal aanwezig
• Dische’s diphenyl-amine assay: verkleuring wijst op DNA, anders RNA
• Molisch’s test: 𝛼-naphtol toevoegen → als er een paarse band vormt →
carbohydraten aanwezig
• Brandford test: verkleuring wijst op aanwezigheid van proteïnen
Standard operating protocol
• SOP: geschreven document waarin alle procedures van een experiment worden beschreven
o Experiment (materialen, oplossingen, leverancier producten)
o Werking toestel (instellingen, verantwoordelijke, onderhoud)
o Gedragsregels labo (labojas, GSM)
o Resultaten verwerken/voorstelling (serienummer, datering)
• SOP wordt steeds gestockeerd op een centrale plaats, en er ligt een kopij op de werktafel
• Nut:
o Opleiding van nieuw personeel
o Veiligheid
o Garandeert goede kwaliteit en reproduceerbaarheid van de resultaten
• Doel:
o GLP (good laboratory practice): set SOP’s voor uitvoering van
laboratoriumtechnieken
o GMP (good manufactoring practice): producten produceren onder soortgelijke regels
2
,Rapportering
• Eenheden
o MKS eenheidsstelsel gebruiken
o Molaire massa in units of Da
• Significante getallen
o Optellen/aftrekken → aantal van minst nauwkeurige
o Vermenigvuldigen/delen → aantal van minst significante
o Wetenschappelijke notaties gebruiken (1000 = 103)
o Foutanalyse conform de cursus van prof. D. Maes
3
, H2 – Celcultivering en celfractionering
Celcultivering
Dierlijke cellijnen
Wat moet je toevoegen aan de celcultuur?
• RPMI of DMEM → bevat zouten, vitamines en glucoses
• FCS: bloedserum uit kalveren → bevat hormonen en nutriënten voor dierlijke cellen
• Antibiotica → zodat er geen bacteriën op groeien
• Fenolrood (= pH-indicator) → geeft aan wanneer de celcultuur ververst moet worden (want
dan vindt verzuring plaats doordat de cellen lactaat produceren)
• Supplementen
Belangrijke supplementen
• L-glutamine
o Essentieel aminozuur dat niet door cellen zelf wordt geproduceerd
o Energiebron (citroenzuurcyclus), gebruikt in eiwitsynthese
o Onstabiel in vloeibare vorm → wordt toegevoegd als supplement
• Niet-essentiele aminozuren (NEAA)
o Energiebron, gebruikt in eiwitsynthese
o Vermindert metabolische stress bij cellen
• Groeifactoren en hormonen (bv: insuline)
o Stimuleert glucosetransport en -gebruik
o Helpt bij opname van aminozuren
o Helpt bij cel-differentiatie
• Antibiotica en antimycotica
o Reduceren het risico op bacteriële en schimmel infecties
o Cellen kunnen antibiotisch resistent worden → verandering in fenotype
o Wordt meestal vermeden in lange-termijn celculturen
o Bv: penicilline, streptomycine, gentamicine, amfotericine B
4
Analytische biochemie
• Analytische chemie: het identificeren van componenten en samenstellingen van oplossingen
o Fundamentele eigenschappen van het analyte: vorm, lading en grootte
o Type analyse: scheiding, identificatie en quantificatie
• Biochemie: studie van chemische componenten en reacties die optreden in levende
organismen
• In vivo: proces dat in het levend organisme plaatsvindt
• In vitro: proces dat in het labo plaatsvindt
Cel-fractionering en cultiveren
• Cellen isoleren → primaire cultuur die niet kan veranderen
• Voordeel: je kan die primaire cultuur steeds gebruiken voor in vitro experimenten, zonder
dat je een levend organisme nodig hebt waaruit je steeds cellen moet halen
• Nadeel: in vitro experimenten wijken soms af van in vivo experimenten
Het pH-concept
• pH is een maateenheid voor de concentratie 𝐻 + ionen in een oplossing
• Bij neutrale pH (= 7) → [𝐻 + ] = [𝑂𝐻 − ] = 10−7 𝑀 → lading van water = 0 als de pH = 7
o Dit is het geval bij 25°C
o Bij 100°C → pH = 6, maar toch is water nog altijd neutraal, verklaring:
▪ Als de T stijgt → moleculen worden dynamischer → evenwichtsconstante
van water verandert (er gaat meer water splitsen in 𝐻 + en 𝑂𝐻 − )
▪ Meer 𝐻 + betekent dat de pH afneemt, maar er wordt evenveel extra 𝑂𝐻 −
geproduceerd → de lading blijft neutraal, terwijl de pH daalt
• 𝑝𝐾𝑎 is de pH-waarde waarbij een biomolecule een gelijke concentratie heeft van zijn
geprotoneerde en gedeprotoneerde vorm
1
,Algemene principes
Voorbereiding
• Stockoplossingen:
o De stock is altijd 10-100-1000x de werkconcentratie
o In maatcilinder: altijd onder de meniscus aflezen
o Bereid de stock altijd op dezelfde pH als het geplande experiment (bij verschillende
pH kunnen bepaalde eiwitten worden uitgeschakeld)
o Bereid de stock altijd op dezelfde T als het geplande experiment (want de pH is T-
afhankelijk)
o Voeg geen onnodige ionen toe, anders ontstaan er ongewenste reactieproducten
(het is dus niet handig om de pH via deze manier op het gewenste niveau te krijgen)
• Verdunningen:
o ¼ verdunning = 1 deel in 3 delen solute
o Niet te veel verdunnen → anders wordt de fout door de pipet te
groot
Protocols
Detectie van componenten in oplossing (zonder opzuivering)
• Gebeurt via een scala aan assays
• Benedict assay: verkleuring wijst op vrije suikers (dus geen genetisch
materiaal)
• Bial’s orcinol test: verkleuring wijst op pentose-suiker → er is genetisch
materiaal aanwezig
• Dische’s diphenyl-amine assay: verkleuring wijst op DNA, anders RNA
• Molisch’s test: 𝛼-naphtol toevoegen → als er een paarse band vormt →
carbohydraten aanwezig
• Brandford test: verkleuring wijst op aanwezigheid van proteïnen
Standard operating protocol
• SOP: geschreven document waarin alle procedures van een experiment worden beschreven
o Experiment (materialen, oplossingen, leverancier producten)
o Werking toestel (instellingen, verantwoordelijke, onderhoud)
o Gedragsregels labo (labojas, GSM)
o Resultaten verwerken/voorstelling (serienummer, datering)
• SOP wordt steeds gestockeerd op een centrale plaats, en er ligt een kopij op de werktafel
• Nut:
o Opleiding van nieuw personeel
o Veiligheid
o Garandeert goede kwaliteit en reproduceerbaarheid van de resultaten
• Doel:
o GLP (good laboratory practice): set SOP’s voor uitvoering van
laboratoriumtechnieken
o GMP (good manufactoring practice): producten produceren onder soortgelijke regels
2
,Rapportering
• Eenheden
o MKS eenheidsstelsel gebruiken
o Molaire massa in units of Da
• Significante getallen
o Optellen/aftrekken → aantal van minst nauwkeurige
o Vermenigvuldigen/delen → aantal van minst significante
o Wetenschappelijke notaties gebruiken (1000 = 103)
o Foutanalyse conform de cursus van prof. D. Maes
3
, H2 – Celcultivering en celfractionering
Celcultivering
Dierlijke cellijnen
Wat moet je toevoegen aan de celcultuur?
• RPMI of DMEM → bevat zouten, vitamines en glucoses
• FCS: bloedserum uit kalveren → bevat hormonen en nutriënten voor dierlijke cellen
• Antibiotica → zodat er geen bacteriën op groeien
• Fenolrood (= pH-indicator) → geeft aan wanneer de celcultuur ververst moet worden (want
dan vindt verzuring plaats doordat de cellen lactaat produceren)
• Supplementen
Belangrijke supplementen
• L-glutamine
o Essentieel aminozuur dat niet door cellen zelf wordt geproduceerd
o Energiebron (citroenzuurcyclus), gebruikt in eiwitsynthese
o Onstabiel in vloeibare vorm → wordt toegevoegd als supplement
• Niet-essentiele aminozuren (NEAA)
o Energiebron, gebruikt in eiwitsynthese
o Vermindert metabolische stress bij cellen
• Groeifactoren en hormonen (bv: insuline)
o Stimuleert glucosetransport en -gebruik
o Helpt bij opname van aminozuren
o Helpt bij cel-differentiatie
• Antibiotica en antimycotica
o Reduceren het risico op bacteriële en schimmel infecties
o Cellen kunnen antibiotisch resistent worden → verandering in fenotype
o Wordt meestal vermeden in lange-termijn celculturen
o Bv: penicilline, streptomycine, gentamicine, amfotericine B
4
