Hoofdstuk 6: Analyse van gentranscriptie regulatie
De regulatie van genexpressie bepaalt welke RNAs en proteïnen gesynthetiseerd worden en hoeveel ervan.
Dit is de basis van cel differentiatie en respons op signalen.
Overzicht:
3.6.1 Nascent RNA analyses
a. 3.6.1.1 Run-on assays:
i. Basis Run-on assay
ii. GRO-Seq
iii. PRO-Seq
b. 3.6.1.2 Andere nascent RNA analyse methoden:
i. Chromatine-geassocieerd nascent RNA isolatie
ii. Pol II-geassocieerd nascent RNA isolatie
iii. Metabolische labeling
c. 3.6.1.3 Imaging-gebaseerde nascent RNA analyse methoden
3.6.2 Promoter-reporter studies
3.6.3 Analyse van protein-DNA interacties (interacties op euchromatine)
a. 3.6.3.1 DNase footprinting
b. 3.6.3.2 EMSA
c. 3.6.3.3 Open chromatine assays:
i. DNase-Seq, DNase-chip
ii. ATAC-seq
iii. FAIRE-seq
d. 3.6.3.4 Chromatine immunoprecipitatie assays
i. ChIP, ChIP-seq, ChIP-chip
1. Nascent RNA analyses
= methode om de transcriptie activiteit te meten via
kwantificatie van gelabelde nascent RNA moleculen, dit is
nieuw afgeschreven RNA.
1.1. Run-on assays:
1.1.1. Basis Run-on assays
= een methode om de activiteit van DNA-polymerase op een bepaald gen te meten.
De cellen worden afgekoeld op ijs zodat alle cellulaire processen bevroren worden. Hierna worden de
nuclei geïsoleerd en de nucleotides verwijdert. Hierna worden nucleotiden gelabeld met 32P-UTP
(radioactief) toegevoegd zodat deze wordt ingebouwd. Ook wordt sarkosyl toegevoegd dat transcriptie-
initiatie blokkeert, zo worden enkel de RNA-moleculen verder afgeschreven die al in de elongatie fase
zaten.
De cellen worden terug op temperatuur gebracht
zodat polymerase weer actief is en de gemerkte
nucleotiden inbouwt. Het RNA wordt daarna
gehybridiseerd op een array met DNA probes.
Vervolgens wordt de hoeveelheid RNA dat van een
bepaald gen afgeschreven is, geanalyseerd.
directe mapping van actieve polymerases
63
, 1.1.2. GRO-Seq (global run-on sequencing)
Deze methode maakt gebruik van gebromeerde UTPs (<-> radioactief) die in het nascent RNA worden
ingebouwd. Vervolgens worden deze RNA-moleculen geëxtraheerd door gebruik te maken van anti-BrdU
antilichamen die op een vaste dragen (beads) zitten. Dit wordt geëlueerd en gesequenced (cDNA synthese
en NGS).
zo kan je bepalen welk gen tot expressie komt
1.1.3. PRO-Seq (precision nuclear run-on sequencing)
De posities van actieve polymerasen kunnen genoombreed geïdentificeerd worden met single-nucleotide
resolutie. We gaan de cellen weer bevriezen en biotine gelabelde nucleotiden toevoegen. Als polymerase
terug actief is, dan zullen deze ingebouwd worden. Maar door de grootte van het label kan er na de
inbouw van het eerste nucleotide geen verdere elongatie plaatsvinden.
Het resultaat is verschillende transcripten van hetzelfde gen, waarvan de lange gefragmenteerd moeten
worden. Vervolgens worden er RNA adaptors aan het 3’ biotine geligeerd en wordt de 5’ cap eraf gehaald.
De RNAs zonder cap worden gefosforyleerd zodat er aan de 5’ ook een adaptor geligeerd kan worden.
Vervolgens wordt er reverse transcriptie, PCR en Next gen sequencing gedaan. Dit gebeurt vanaf de 3’
richting, omdat dan het eerste onbekende nucleotide de gebiotinileerde nucleotide is.
Nadeel: Door fragmentatie verlies je de locatie van de transcriptie startplaats in de langere sequenties. Een
oplossing hiervoor is PRO-cap, waarbij men het gecapt RNA gaat amplificeren door ligatie van een 5’ oligo.
De oligo’s zonder cap worden gedefosforyleerd, zodat de RNA-moleculen die niet begonnen waren met
transcriptie niet kunnen geamplificeerd kunnen worden in PCR. Je gaat deze dus niet sequencen, waardoor
de transcriptie startplaats bepaald kan worden van een gen.
1.2. Andere nascent RNA analyse methoden:
1.2.1. Chromatine-geassocieerde nascent RNA isolatie
= isolatie van de RNA-moleculen die nog aan het chromatine hangen via
RNA-polymerase. Al het andere RNA wordt weggewassen via verschillende
zoutbuffers. Het nadeel is dat ook RNA dat in het spliceosoom zit en long-non-coding RNA
mee geïsoleerd worden. Dit zorgt voor een achtergrond signaal.
Een oplossing hiervoor is dat we het RNA zonder cap verrijken met een fosfaatgroep (fosforyleren <->
defosforylatie bij PRO-seq) en vervolgens 5’fosfo-exonuclease toevoegen. Dit gaat dan het ongecapt RNA
afbreken.
Volgende stap (net als bij alles hierboven en de andere methoden!) is om RNA seq te doen of NGS om de
RNA’s te bepalen van de bepaalde genen die dan tot expressie kwamen.
1.2.2. Pol II-geassocieerd nascent RNA isolatie
= isolatie van het RNA dat geassocieerd is met polymerase 2 via
chromatine immunoprecipitatie. Hiervoor wordt een antilichaam tegen
de polymerase gebruikt en vervolgens kan het RNA geëxtraheerd
worden. Dan weet je welk RNA geassocieerd was met polymerases op dat moment
64
De regulatie van genexpressie bepaalt welke RNAs en proteïnen gesynthetiseerd worden en hoeveel ervan.
Dit is de basis van cel differentiatie en respons op signalen.
Overzicht:
3.6.1 Nascent RNA analyses
a. 3.6.1.1 Run-on assays:
i. Basis Run-on assay
ii. GRO-Seq
iii. PRO-Seq
b. 3.6.1.2 Andere nascent RNA analyse methoden:
i. Chromatine-geassocieerd nascent RNA isolatie
ii. Pol II-geassocieerd nascent RNA isolatie
iii. Metabolische labeling
c. 3.6.1.3 Imaging-gebaseerde nascent RNA analyse methoden
3.6.2 Promoter-reporter studies
3.6.3 Analyse van protein-DNA interacties (interacties op euchromatine)
a. 3.6.3.1 DNase footprinting
b. 3.6.3.2 EMSA
c. 3.6.3.3 Open chromatine assays:
i. DNase-Seq, DNase-chip
ii. ATAC-seq
iii. FAIRE-seq
d. 3.6.3.4 Chromatine immunoprecipitatie assays
i. ChIP, ChIP-seq, ChIP-chip
1. Nascent RNA analyses
= methode om de transcriptie activiteit te meten via
kwantificatie van gelabelde nascent RNA moleculen, dit is
nieuw afgeschreven RNA.
1.1. Run-on assays:
1.1.1. Basis Run-on assays
= een methode om de activiteit van DNA-polymerase op een bepaald gen te meten.
De cellen worden afgekoeld op ijs zodat alle cellulaire processen bevroren worden. Hierna worden de
nuclei geïsoleerd en de nucleotides verwijdert. Hierna worden nucleotiden gelabeld met 32P-UTP
(radioactief) toegevoegd zodat deze wordt ingebouwd. Ook wordt sarkosyl toegevoegd dat transcriptie-
initiatie blokkeert, zo worden enkel de RNA-moleculen verder afgeschreven die al in de elongatie fase
zaten.
De cellen worden terug op temperatuur gebracht
zodat polymerase weer actief is en de gemerkte
nucleotiden inbouwt. Het RNA wordt daarna
gehybridiseerd op een array met DNA probes.
Vervolgens wordt de hoeveelheid RNA dat van een
bepaald gen afgeschreven is, geanalyseerd.
directe mapping van actieve polymerases
63
, 1.1.2. GRO-Seq (global run-on sequencing)
Deze methode maakt gebruik van gebromeerde UTPs (<-> radioactief) die in het nascent RNA worden
ingebouwd. Vervolgens worden deze RNA-moleculen geëxtraheerd door gebruik te maken van anti-BrdU
antilichamen die op een vaste dragen (beads) zitten. Dit wordt geëlueerd en gesequenced (cDNA synthese
en NGS).
zo kan je bepalen welk gen tot expressie komt
1.1.3. PRO-Seq (precision nuclear run-on sequencing)
De posities van actieve polymerasen kunnen genoombreed geïdentificeerd worden met single-nucleotide
resolutie. We gaan de cellen weer bevriezen en biotine gelabelde nucleotiden toevoegen. Als polymerase
terug actief is, dan zullen deze ingebouwd worden. Maar door de grootte van het label kan er na de
inbouw van het eerste nucleotide geen verdere elongatie plaatsvinden.
Het resultaat is verschillende transcripten van hetzelfde gen, waarvan de lange gefragmenteerd moeten
worden. Vervolgens worden er RNA adaptors aan het 3’ biotine geligeerd en wordt de 5’ cap eraf gehaald.
De RNAs zonder cap worden gefosforyleerd zodat er aan de 5’ ook een adaptor geligeerd kan worden.
Vervolgens wordt er reverse transcriptie, PCR en Next gen sequencing gedaan. Dit gebeurt vanaf de 3’
richting, omdat dan het eerste onbekende nucleotide de gebiotinileerde nucleotide is.
Nadeel: Door fragmentatie verlies je de locatie van de transcriptie startplaats in de langere sequenties. Een
oplossing hiervoor is PRO-cap, waarbij men het gecapt RNA gaat amplificeren door ligatie van een 5’ oligo.
De oligo’s zonder cap worden gedefosforyleerd, zodat de RNA-moleculen die niet begonnen waren met
transcriptie niet kunnen geamplificeerd kunnen worden in PCR. Je gaat deze dus niet sequencen, waardoor
de transcriptie startplaats bepaald kan worden van een gen.
1.2. Andere nascent RNA analyse methoden:
1.2.1. Chromatine-geassocieerde nascent RNA isolatie
= isolatie van de RNA-moleculen die nog aan het chromatine hangen via
RNA-polymerase. Al het andere RNA wordt weggewassen via verschillende
zoutbuffers. Het nadeel is dat ook RNA dat in het spliceosoom zit en long-non-coding RNA
mee geïsoleerd worden. Dit zorgt voor een achtergrond signaal.
Een oplossing hiervoor is dat we het RNA zonder cap verrijken met een fosfaatgroep (fosforyleren <->
defosforylatie bij PRO-seq) en vervolgens 5’fosfo-exonuclease toevoegen. Dit gaat dan het ongecapt RNA
afbreken.
Volgende stap (net als bij alles hierboven en de andere methoden!) is om RNA seq te doen of NGS om de
RNA’s te bepalen van de bepaalde genen die dan tot expressie kwamen.
1.2.2. Pol II-geassocieerd nascent RNA isolatie
= isolatie van het RNA dat geassocieerd is met polymerase 2 via
chromatine immunoprecipitatie. Hiervoor wordt een antilichaam tegen
de polymerase gebruikt en vervolgens kan het RNA geëxtraheerd
worden. Dan weet je welk RNA geassocieerd was met polymerases op dat moment
64
