Samenvatting Biochemie en Proteomics
Affiniteitschromatografie
Paragraaf 6.1 Inleiding tot affiniteitschromatografie
Eiwitten worden gesynthetiseerd uit de informatie in genen. Als resultaat hebben ze
elk een ander gehalte en totaal aantal aminozuren.
Affiniteitschromatografie maakt gebruik van biospecificiteit van een doeleiwit om een
doeleiwit uit een complex eiwitmengsel op te lossen. Het gaat om een interactie
tussen een ligand (klein molecuul zoals enzymsubstraat) dat is geïmmobiliseerd op
een hars (stationaire fase) en een doeleiwit dat in de vloeibare fase zit (mobiele fase).
Enzymen zullen aan deze substraten bindne omdat hun actieve plaatsen
stereospecifiek worden bij binding aan het substraat. Daarom kan het substraat van
een enzym dat op een hars is geïmmobiliseerd, worden gebruikt om een
doelwitenzym te binden aan de uitsluiting van alle andere eiwitten die in het mengsel
aanwezig zijn.
Andere eiwitten zullen niet aan de ligand binden omdat hun actieve plaatsen
niet overeen komen met de 3D vorm van het ligandmolecuul. Ze sijpelen door
de hars en elueren in de ongebonden fractie.
Paragraaf 6.2 De hars die wordt gebruikt bij affiniteitschromatografie
Er is een ruime keuze aan harsen beschikbaar voor affiniteitschromatografie,
waaronder agarose, Sephadex, polyacrylamide en silica. Als de hars poreurs is
(agarose of Sepharose), zal een grote poriegrootte (deeltjes tussen 50 – 400 μm)
eventuele grootte-uitsluitingseffecten van de hars helpen minimaliseren. Bovendien
moet de hars chemisch stabiel zijn tijdens ligandkoppeling en tijdens de
chromatografie van de doelwil eiwitten.
Paragraaf 6.3 De affiniteits ligand
P+L PL
Eiwit + Ligand EiwitLigandComplex
De evenwichts/affiniteit constante Ka voor de interactie tussen een eiwit en een ligand
wordt gegeven door:
Ka = [PL]
[P] [L]
Waarbij: [PL] de concentratie van het eiwitligandcomplex is
[P] de concentratie van het eiwit is
[L] de concentratie van vrij ligand is
Een waarde voor Ka kan worden bepaald met behulp van evenwichtsdialyse. Waarden
tussen de 10-5 en 10-11 Molair zijn vereist voor een goede affiniteits ligand.
Het is belangrijk om te onthouden dat wanneer een ligand aan een hars is
gebonden, het niet langer volledig vrij is rond elk atoom. Vooral het atoom dat
wordt gebruikt om de ligand aan de hars te bevestigen, zal een beperkte
beweging hebben in vergelijking met de vrije ligand.
Hierdoor kan de waarde voor Ka tussen een eiwit en een ligand tot wel duizend
keer kleiner zijn wanneer de ligand aan een hars is gebonden.
Succesvolle affiniteitschromatografie hangt af van de reversibele binding van het
doelwit molecuul aan een ligand dat aan een hars is bevestigd.
De interactie moet sterk genoeg zijn om het doeleiwit vast te houden aan de
hars
, De interactie moet zwak genoeg zijn om zachte elutiecondities toe te passen
(stijging van concentratie van vrij ligand of stijging in zoutconcentratie) die de
eiwitligand interactie zullen verbreken, wat resulteert in hoge opbrengst en
zuiverheid van het eiwit.
Spacer arm
Wanneer kleine liganden aan een affiniteitshars zijn gehecht, bevinden ze zich fysiek
dicht bij het oppervlak van de hars, wat va invloed kan zijn op het vermogen van een
doeleiwit om aan het ligand te plakken. Om dit toch te laten slagen, kan het zijn dat
kleine liganden een space arm nodig hebben om de ligand verder van het oppervlak
van de hars te plaatsen. Hierdoor is een interactie tussen de ligand en het doeleiwit
succesvoller.
Een spacer arm is meestal 6 – 10 koolstofatomen lang.
De structuur van de spacer arm kunnen belangrijke aanvullende factoren zijn bij
het bepalen van een succesvolle interactie.
o Dit is door het bevorderen van een H-binding, hydrofoob, ionisch of dipool
interacties tussen de spacer arm en het eiwit dat aan de hars bindt.
De koppeling van
eiwitten met een
vrije aminogroep
aan een cyanogeen
bromide
geactiveerde
Sephadex.
De koppeling van
eiwitten met een
vrije aminogroep
aan een
cyanogeen
bromide
geactiveerde
Sephadex.
Grote liganden kunnen direct aan een affiniteits hars worden gehecht en toch hun
aantrekkelijkheid voor het doel molecuul behouden. Een eiwit zal typisch worden
gehecht aan een hars via de ε -aminogroep van lysineresiduen.
Eiwitten bevatten veel ε -aminogroepen en hebben dus meerdere
hechtingsplaatsen voor aan de affiniteits hars.Dit zal de oriëntatie van het
ligand-eiwit beïnvloeden, resulterend in veel aanhechtingen, aangezien slechts
een beperkt aantal van de eiwitten in de juiste oriëntatie zal zijn.
Of de ligand die aan de affiniteitshars is gehecht nu groot of klein is, ze mogen niet uit
de kolom lekken tijdens het affiniteitsproces. Kleine verontreinigende stukjes van de
affiniteits ligand kunnen een probleem zijn bij de zuivering en het gebruik van
therapeutische eiwitten.
,Paragraaf 6.4 De binding- en elutie voorwaarden voor affiniteits chromatografie
De binding moet uitgevoerd worden in een buffer die is ingesteld op een pH die
een interactie tussen het doeleiwit en de ligand stimuleert. Dit moet ±1,0 zijn,
ongeveer het pH-optimum van een enzym.
o De ligad (aan de hars) heeft enige bewegingsbeperking en dit kan invloed
hebben op de optimale pH voor binding en elutie.
Als de affiniteitsinteractie hydrofobe krachten omvat, kan de opname van 0,1 –
0,5 M NaCl de binding bevorderenen ook helpen om eventuele niet-specifieke
ionenuitwisselingsinteracties tussen de eiwitten in het monster en de
affiniteitshars te overwinnen.
Vanwege de specificiteit van de interacties bij affiniteitschromatografie, kunnen
kolommen met kleinere volumes (<20,0 mL) die met lage stroomsnelheden
worden gebruikt, de affiniteitsinteracties helpen door massaoverdracht tussen
het doeleiwit in de mobiele fase en de ligand te bevorderen op de stationaire
fase.
Als je merkt dat het doeleiwit in een lage concentratie aanwezig is, kan de
stroom door de kolom vele uren met een lage stroomsnelheid worden
gerecycled voordat de kolom wordt gewassen en geëlueerd.
o Als alternatief kan de affiniteitshars worden gemengd met het monster in
een end-over-end menger gedurende een bepaalde periode voordat het
mengsel van hars en monster over een kolom wordt geladen en
gewassen. Dit om het ongebonden materiaal te verwijderen en het wordt
onderworpen aan de elutievoorwaarden.
Stroomschema affiniteits chromatografie
A) Kies een geschikte ligand
B) Bind het ligand aan de hars
Breng de hars (en het monster) in evenwicht
onder geschikte omstandigheden
C) Breng het monster aan (in lage
stroomsnelheid
Het doeleiwit bindt niet aan
Het doeleiwit bindt Het doeleiwit bindt
de hars maar elueert als een
niet en elueert in de aan de hars.
brede band in de laatste
ongebonden fractie.
fracties van de ongebonden
fractie. Specifiek Niet-
e specifieke
Bindt het ligand via
Probeer de startcondities verplaatsi verplaatsi
een andere
(pH, zout of cofactore) te ng
reactieve groep (ga
veranderen of verpak de
naar B). Elueer met
hars opnieuw in een lange, Hoog zout
concentratie
dunne kolom.
substraat/
Gebruik een andere
remmer Probeer
ligand (activator /
remmer) (terug met 3M
Doeleiwit KSCN en
naar A)
elueert 0,1% SDS
Probeer eventueel Controle
Eiwit
, Afhankelijk van de mate van interactie tussen het doeleiwit in de mobiele fase en het
ligand gebonden aan de stationaire fase, kunnen er een aantal uitkomsten zij:
1. Ideaal: als de ligand concentratie hoog is en er is een sterke associatie tussen
het doeleiwit en het ligand.
Het vrije eiwit wordt onmiddelijk gevangen door het vrije ligand, wat
resulteert in een geconcentreerde band van het doeleiwit aan de
bovenkant vande hars in de kolom.
De elutieomstandigheden zullen het evenwicht verschuiven ten gunste
van vrij eiwit in de mobiele fase, wat resulteert in het elueren van het
doeleiwit in een enkele scherpe piek.
2. Als de interactie tussen het doeleiwit en het gebonden ligand zwak is.
Het eiwit kan op en van het ligand verplaatsen. De voortgang van de
kolom zal opnieuw worden gestart en het zal later in het elutie profiel van
de ongebonden eiwitten elueren.
Als dit het geval is moet het monster worden aangebracht op de
affiniteitshars, verpakt in een lange dunne kolom, met een stroomsnelheid
bij een temperatuur lager dan kamertemperatuur.
o Dit zal de interactie tussen het doeleiwit en de affiniteits ligand
helpen maximaliseren, waardoor de voortgang van het doeleiwit
langs de kolom wordt vertraagd, zodat het elueert (waarschijnlijk in
een brede piek) nadat het ongebonden en ongewenste eiwit is
geëlueerd.
Verplaatsing van het doeleiwit dat aan de ligand op de hars is gebonden, kan worden
bereikt door een hoge concentratie van het substraat van het doelenzym te
gebruiken. Als alternatief kan een remmer (of activator) gebruikt worden om
conformatieveranderingen in het gebonden eiwit te verlagen om specifiek
ligandgebonden enzymen te verdringen.
Als het enzym een cofactor (zoals metaalionen) vereist, kan de opname van
EDTA of andere chelerende regentia in de elutiebuffer verdringing avn het
gebonden eiwit veroorzaken.
Vaak zal specifieke verplaatsing het doeleiwit niet verwijderen uit de ligand en moet
niet-specifieke verplaatsingsomstandigheden worden gebruikt. Niet-specifieke
elutieprocedures zijn:
1. Het verhogen van de zoutconcentratie tot >1,0 M NaCl
2. Het verlagen an de pH tot 2,0
Als een drastische verandering in pH wordt gebruikt voor elutie, moet ervoor worden
gezorgd dat het geëlueerde eiwit kan worden geminimaliseerd door:
a) De lengte van de slang tussen de kolomuitlaat en de fractiecollector (dood
volume) te verminderen
b) Een klein volume geconcentreerde buffer op te nemen in de bodem van de
fractiecollector buizen.
o Dit minimaliseert de tijd die het doeleiwit in een omgeving met een lage
pH doorbrengt.
Niet-specifieke
verplaatsingsomstandigheden kunnen
zorgen voor een goed herstel van het
doeleiwit, maar in de meeste gevallen
zal de ervaring van een omgeving
met een lage pH resulteren in een
slecht herstel van biologische
activiteit.
Affiniteitschromatografie
Paragraaf 6.1 Inleiding tot affiniteitschromatografie
Eiwitten worden gesynthetiseerd uit de informatie in genen. Als resultaat hebben ze
elk een ander gehalte en totaal aantal aminozuren.
Affiniteitschromatografie maakt gebruik van biospecificiteit van een doeleiwit om een
doeleiwit uit een complex eiwitmengsel op te lossen. Het gaat om een interactie
tussen een ligand (klein molecuul zoals enzymsubstraat) dat is geïmmobiliseerd op
een hars (stationaire fase) en een doeleiwit dat in de vloeibare fase zit (mobiele fase).
Enzymen zullen aan deze substraten bindne omdat hun actieve plaatsen
stereospecifiek worden bij binding aan het substraat. Daarom kan het substraat van
een enzym dat op een hars is geïmmobiliseerd, worden gebruikt om een
doelwitenzym te binden aan de uitsluiting van alle andere eiwitten die in het mengsel
aanwezig zijn.
Andere eiwitten zullen niet aan de ligand binden omdat hun actieve plaatsen
niet overeen komen met de 3D vorm van het ligandmolecuul. Ze sijpelen door
de hars en elueren in de ongebonden fractie.
Paragraaf 6.2 De hars die wordt gebruikt bij affiniteitschromatografie
Er is een ruime keuze aan harsen beschikbaar voor affiniteitschromatografie,
waaronder agarose, Sephadex, polyacrylamide en silica. Als de hars poreurs is
(agarose of Sepharose), zal een grote poriegrootte (deeltjes tussen 50 – 400 μm)
eventuele grootte-uitsluitingseffecten van de hars helpen minimaliseren. Bovendien
moet de hars chemisch stabiel zijn tijdens ligandkoppeling en tijdens de
chromatografie van de doelwil eiwitten.
Paragraaf 6.3 De affiniteits ligand
P+L PL
Eiwit + Ligand EiwitLigandComplex
De evenwichts/affiniteit constante Ka voor de interactie tussen een eiwit en een ligand
wordt gegeven door:
Ka = [PL]
[P] [L]
Waarbij: [PL] de concentratie van het eiwitligandcomplex is
[P] de concentratie van het eiwit is
[L] de concentratie van vrij ligand is
Een waarde voor Ka kan worden bepaald met behulp van evenwichtsdialyse. Waarden
tussen de 10-5 en 10-11 Molair zijn vereist voor een goede affiniteits ligand.
Het is belangrijk om te onthouden dat wanneer een ligand aan een hars is
gebonden, het niet langer volledig vrij is rond elk atoom. Vooral het atoom dat
wordt gebruikt om de ligand aan de hars te bevestigen, zal een beperkte
beweging hebben in vergelijking met de vrije ligand.
Hierdoor kan de waarde voor Ka tussen een eiwit en een ligand tot wel duizend
keer kleiner zijn wanneer de ligand aan een hars is gebonden.
Succesvolle affiniteitschromatografie hangt af van de reversibele binding van het
doelwit molecuul aan een ligand dat aan een hars is bevestigd.
De interactie moet sterk genoeg zijn om het doeleiwit vast te houden aan de
hars
, De interactie moet zwak genoeg zijn om zachte elutiecondities toe te passen
(stijging van concentratie van vrij ligand of stijging in zoutconcentratie) die de
eiwitligand interactie zullen verbreken, wat resulteert in hoge opbrengst en
zuiverheid van het eiwit.
Spacer arm
Wanneer kleine liganden aan een affiniteitshars zijn gehecht, bevinden ze zich fysiek
dicht bij het oppervlak van de hars, wat va invloed kan zijn op het vermogen van een
doeleiwit om aan het ligand te plakken. Om dit toch te laten slagen, kan het zijn dat
kleine liganden een space arm nodig hebben om de ligand verder van het oppervlak
van de hars te plaatsen. Hierdoor is een interactie tussen de ligand en het doeleiwit
succesvoller.
Een spacer arm is meestal 6 – 10 koolstofatomen lang.
De structuur van de spacer arm kunnen belangrijke aanvullende factoren zijn bij
het bepalen van een succesvolle interactie.
o Dit is door het bevorderen van een H-binding, hydrofoob, ionisch of dipool
interacties tussen de spacer arm en het eiwit dat aan de hars bindt.
De koppeling van
eiwitten met een
vrije aminogroep
aan een cyanogeen
bromide
geactiveerde
Sephadex.
De koppeling van
eiwitten met een
vrije aminogroep
aan een
cyanogeen
bromide
geactiveerde
Sephadex.
Grote liganden kunnen direct aan een affiniteits hars worden gehecht en toch hun
aantrekkelijkheid voor het doel molecuul behouden. Een eiwit zal typisch worden
gehecht aan een hars via de ε -aminogroep van lysineresiduen.
Eiwitten bevatten veel ε -aminogroepen en hebben dus meerdere
hechtingsplaatsen voor aan de affiniteits hars.Dit zal de oriëntatie van het
ligand-eiwit beïnvloeden, resulterend in veel aanhechtingen, aangezien slechts
een beperkt aantal van de eiwitten in de juiste oriëntatie zal zijn.
Of de ligand die aan de affiniteitshars is gehecht nu groot of klein is, ze mogen niet uit
de kolom lekken tijdens het affiniteitsproces. Kleine verontreinigende stukjes van de
affiniteits ligand kunnen een probleem zijn bij de zuivering en het gebruik van
therapeutische eiwitten.
,Paragraaf 6.4 De binding- en elutie voorwaarden voor affiniteits chromatografie
De binding moet uitgevoerd worden in een buffer die is ingesteld op een pH die
een interactie tussen het doeleiwit en de ligand stimuleert. Dit moet ±1,0 zijn,
ongeveer het pH-optimum van een enzym.
o De ligad (aan de hars) heeft enige bewegingsbeperking en dit kan invloed
hebben op de optimale pH voor binding en elutie.
Als de affiniteitsinteractie hydrofobe krachten omvat, kan de opname van 0,1 –
0,5 M NaCl de binding bevorderenen ook helpen om eventuele niet-specifieke
ionenuitwisselingsinteracties tussen de eiwitten in het monster en de
affiniteitshars te overwinnen.
Vanwege de specificiteit van de interacties bij affiniteitschromatografie, kunnen
kolommen met kleinere volumes (<20,0 mL) die met lage stroomsnelheden
worden gebruikt, de affiniteitsinteracties helpen door massaoverdracht tussen
het doeleiwit in de mobiele fase en de ligand te bevorderen op de stationaire
fase.
Als je merkt dat het doeleiwit in een lage concentratie aanwezig is, kan de
stroom door de kolom vele uren met een lage stroomsnelheid worden
gerecycled voordat de kolom wordt gewassen en geëlueerd.
o Als alternatief kan de affiniteitshars worden gemengd met het monster in
een end-over-end menger gedurende een bepaalde periode voordat het
mengsel van hars en monster over een kolom wordt geladen en
gewassen. Dit om het ongebonden materiaal te verwijderen en het wordt
onderworpen aan de elutievoorwaarden.
Stroomschema affiniteits chromatografie
A) Kies een geschikte ligand
B) Bind het ligand aan de hars
Breng de hars (en het monster) in evenwicht
onder geschikte omstandigheden
C) Breng het monster aan (in lage
stroomsnelheid
Het doeleiwit bindt niet aan
Het doeleiwit bindt Het doeleiwit bindt
de hars maar elueert als een
niet en elueert in de aan de hars.
brede band in de laatste
ongebonden fractie.
fracties van de ongebonden
fractie. Specifiek Niet-
e specifieke
Bindt het ligand via
Probeer de startcondities verplaatsi verplaatsi
een andere
(pH, zout of cofactore) te ng
reactieve groep (ga
veranderen of verpak de
naar B). Elueer met
hars opnieuw in een lange, Hoog zout
concentratie
dunne kolom.
substraat/
Gebruik een andere
remmer Probeer
ligand (activator /
remmer) (terug met 3M
Doeleiwit KSCN en
naar A)
elueert 0,1% SDS
Probeer eventueel Controle
Eiwit
, Afhankelijk van de mate van interactie tussen het doeleiwit in de mobiele fase en het
ligand gebonden aan de stationaire fase, kunnen er een aantal uitkomsten zij:
1. Ideaal: als de ligand concentratie hoog is en er is een sterke associatie tussen
het doeleiwit en het ligand.
Het vrije eiwit wordt onmiddelijk gevangen door het vrije ligand, wat
resulteert in een geconcentreerde band van het doeleiwit aan de
bovenkant vande hars in de kolom.
De elutieomstandigheden zullen het evenwicht verschuiven ten gunste
van vrij eiwit in de mobiele fase, wat resulteert in het elueren van het
doeleiwit in een enkele scherpe piek.
2. Als de interactie tussen het doeleiwit en het gebonden ligand zwak is.
Het eiwit kan op en van het ligand verplaatsen. De voortgang van de
kolom zal opnieuw worden gestart en het zal later in het elutie profiel van
de ongebonden eiwitten elueren.
Als dit het geval is moet het monster worden aangebracht op de
affiniteitshars, verpakt in een lange dunne kolom, met een stroomsnelheid
bij een temperatuur lager dan kamertemperatuur.
o Dit zal de interactie tussen het doeleiwit en de affiniteits ligand
helpen maximaliseren, waardoor de voortgang van het doeleiwit
langs de kolom wordt vertraagd, zodat het elueert (waarschijnlijk in
een brede piek) nadat het ongebonden en ongewenste eiwit is
geëlueerd.
Verplaatsing van het doeleiwit dat aan de ligand op de hars is gebonden, kan worden
bereikt door een hoge concentratie van het substraat van het doelenzym te
gebruiken. Als alternatief kan een remmer (of activator) gebruikt worden om
conformatieveranderingen in het gebonden eiwit te verlagen om specifiek
ligandgebonden enzymen te verdringen.
Als het enzym een cofactor (zoals metaalionen) vereist, kan de opname van
EDTA of andere chelerende regentia in de elutiebuffer verdringing avn het
gebonden eiwit veroorzaken.
Vaak zal specifieke verplaatsing het doeleiwit niet verwijderen uit de ligand en moet
niet-specifieke verplaatsingsomstandigheden worden gebruikt. Niet-specifieke
elutieprocedures zijn:
1. Het verhogen van de zoutconcentratie tot >1,0 M NaCl
2. Het verlagen an de pH tot 2,0
Als een drastische verandering in pH wordt gebruikt voor elutie, moet ervoor worden
gezorgd dat het geëlueerde eiwit kan worden geminimaliseerd door:
a) De lengte van de slang tussen de kolomuitlaat en de fractiecollector (dood
volume) te verminderen
b) Een klein volume geconcentreerde buffer op te nemen in de bodem van de
fractiecollector buizen.
o Dit minimaliseert de tijd die het doeleiwit in een omgeving met een lage
pH doorbrengt.
Niet-specifieke
verplaatsingsomstandigheden kunnen
zorgen voor een goed herstel van het
doeleiwit, maar in de meeste gevallen
zal de ervaring van een omgeving
met een lage pH resulteren in een
slecht herstel van biologische
activiteit.
