Naam: Xuan Su Naam partner: Karen Aalbers
Studentnummer: 2488841 Assistenten: Cleo Demeester,
Groep: 1D1 X Romeo Schrage
Datum: 15 oktober 2019
Eiwit:
Isolatie van
His6-b-
galactosidase
, Samenvatting
Het doel was het isoleren van zuiver His6-b-galactosidase uit de bacterie Escherichia Coli (E.
Coli). Hiervoor werden er verschillende preparaten en monsters gemaakt van voor en na de
zuivering. Door de vele monsters werd het makkelijker te bepalen bij welke zuiveringsstap er
verlies aan enzym zou zijn geweest. De zuivering werd gedaan door
affiniteitschromatografie. Door een ionenwisselaar als kolom te kiezen en Imidazol als
structuuranalogon werd er zuiver His6-b-galactosidase verkregen. Door aan de fracties
ONPG toe te voegen werd er bepaald waar de hoogste activiteit had plaats gevonden.
Hieruit kwamen drie piekfracties met zuiver His6-b-galactosidase. De zuiverheidsbepalingen
werden door een SDS-page en een natieve page gedaan. Beiden werden geladen met alle
monsters zodat de resultaten elkaar opvulden als er ergens onduidelijkheid was. Door een
Bradford Assay te gebruiken werd de hoeveelheid eiwit bepaald waarmee berekend werd
hoeveel zuiver His6-b-galactosidase er uiteindelijk is verkregen. De activiteit is gemeten door
een ONPG-assay. De absorbantie werd gemeten in een spectrofotometer en daaruit werd
bepaald wat de reactiesnelheid was. De reactiesnelheid was van belang doordat er met dat
gegeven de opbrengst werd berekend. Er is ook zuiver His6-b-galactosidase verloren gegaan
aangezien de zuiveringsfactor van de oplosbare fractie 2,22 is en die van het gezuiverde
enzym 1,58. De opbrengst zuiver His6-b-galactosidase was uiteindelijk 42%.
Inleiding
His6-b-galactosidase is een enzym die de hydrolyse reactie versnelt waardoor de
glucosidische verbinding tussen glucose en galactose wordt verbroken. Voordat de zuivering
begon werden er preparaten gemaakt waaruit de monsters werden gehaald. Door meerdere
monsters te nemen tijdens het proces werd het mogelijk de opbrengst en zuiverheid goed te
volgen. Dit was handig voor, als er verlies plaats zou vinden, het makkelijk te achterhalen
wanneer dit was gebeurd. Het doel was om zuiver His6-b-galactosidase uit E. Coli te
isoleren. Er werd ook ondervonden of deze methode aan te bevelen is om grote
hoeveelheden of zeer zuiver eiwit te verkrijgen. Eerst werden alle cellen opgebroken (lysis)
van E. Coli. Er werd bij het zuiveren gebruik gemaakt van affiniteitschromatografie. Bij
affiniteitschromatografie wordt de scheiding gedaan door een kolom. Een kolom bestaat uit
materiaal met specifieke bindingseigenschappen. Bij dit experiment was er gekozen voor
een ionenwisselaar wat betekent dat het kolom bepaalde moleculen hecht door elektrische
lading. Hierdoor werd hetgeen wat werd aangetrokken gescheiden van de rest van de
Studentnummer: 2488841 Assistenten: Cleo Demeester,
Groep: 1D1 X Romeo Schrage
Datum: 15 oktober 2019
Eiwit:
Isolatie van
His6-b-
galactosidase
, Samenvatting
Het doel was het isoleren van zuiver His6-b-galactosidase uit de bacterie Escherichia Coli (E.
Coli). Hiervoor werden er verschillende preparaten en monsters gemaakt van voor en na de
zuivering. Door de vele monsters werd het makkelijker te bepalen bij welke zuiveringsstap er
verlies aan enzym zou zijn geweest. De zuivering werd gedaan door
affiniteitschromatografie. Door een ionenwisselaar als kolom te kiezen en Imidazol als
structuuranalogon werd er zuiver His6-b-galactosidase verkregen. Door aan de fracties
ONPG toe te voegen werd er bepaald waar de hoogste activiteit had plaats gevonden.
Hieruit kwamen drie piekfracties met zuiver His6-b-galactosidase. De zuiverheidsbepalingen
werden door een SDS-page en een natieve page gedaan. Beiden werden geladen met alle
monsters zodat de resultaten elkaar opvulden als er ergens onduidelijkheid was. Door een
Bradford Assay te gebruiken werd de hoeveelheid eiwit bepaald waarmee berekend werd
hoeveel zuiver His6-b-galactosidase er uiteindelijk is verkregen. De activiteit is gemeten door
een ONPG-assay. De absorbantie werd gemeten in een spectrofotometer en daaruit werd
bepaald wat de reactiesnelheid was. De reactiesnelheid was van belang doordat er met dat
gegeven de opbrengst werd berekend. Er is ook zuiver His6-b-galactosidase verloren gegaan
aangezien de zuiveringsfactor van de oplosbare fractie 2,22 is en die van het gezuiverde
enzym 1,58. De opbrengst zuiver His6-b-galactosidase was uiteindelijk 42%.
Inleiding
His6-b-galactosidase is een enzym die de hydrolyse reactie versnelt waardoor de
glucosidische verbinding tussen glucose en galactose wordt verbroken. Voordat de zuivering
begon werden er preparaten gemaakt waaruit de monsters werden gehaald. Door meerdere
monsters te nemen tijdens het proces werd het mogelijk de opbrengst en zuiverheid goed te
volgen. Dit was handig voor, als er verlies plaats zou vinden, het makkelijk te achterhalen
wanneer dit was gebeurd. Het doel was om zuiver His6-b-galactosidase uit E. Coli te
isoleren. Er werd ook ondervonden of deze methode aan te bevelen is om grote
hoeveelheden of zeer zuiver eiwit te verkrijgen. Eerst werden alle cellen opgebroken (lysis)
van E. Coli. Er werd bij het zuiveren gebruik gemaakt van affiniteitschromatografie. Bij
affiniteitschromatografie wordt de scheiding gedaan door een kolom. Een kolom bestaat uit
materiaal met specifieke bindingseigenschappen. Bij dit experiment was er gekozen voor
een ionenwisselaar wat betekent dat het kolom bepaalde moleculen hecht door elektrische
lading. Hierdoor werd hetgeen wat werd aangetrokken gescheiden van de rest van de
