Cours n°3 Biologie Cellulaire
Théorie du signal et Ré2culum Endoplasmique
TOUTES les protéines codées par le génome nucléaire commencent leur synthèse dans le cytosol.
Certaines protéines terminent leur synthèse dans le ré2culum endoplasmique.
Le RE occupe tout le volume cellulaire. La membrane externe est con=nue avec la membrane qui délimite le RE.
Où sont synthé2sées les protéines d’une cellule sécrétrice ?
Approche expérimentale : Pulse-Chase (ou marquage métabolique)
Georges PALADE a eu un prix Nobel en 1974.
Il a réalisé un pulse-chase sur des cellules de pancréas exocrine, autoradiographie, MET.
Les protéines en cours de synthèse deviennent radioac2ves. On effectue des lavages pour enlever la leucine
radioac2ve.
Ce qui nous intéresse c’est où sont fabriquées les protéines, dans le cytosol ou le RE ?
On met ensuite la tranche de pancréas sur une lamelle afin d’observer en MOT. On va ensuite observer où les grains
d’argents ce sont formés.
On observe que les grains d’agent (noirs) sont associées au ré2culum endoplasmique rugueux.
Les protéines sont donc généralement formées au niveau du RER.
I. Un signal de ciblage vers le RE a été iden2fié
Existe-t-il un contrôle du ciblage des protéines au RE ?
Approche expérimentale : Recons9tu9on in vitro du transport, vers le RE, des protéines en cours de traduc9on
G. Blodel a eu un prix Nobel en 1999
1. Lyse mécanique des cellules par la technique du PoRer
Il y a d’autres techniques comme :
- Ultra-sons
- Lyse hypotonique
- Passage par un trou d’aiguille
- Bombe à cavita=on (pression)
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, Cours n°3 Biologie Cellulaire
Les cellules ne passent pas en en=er, elles sont é=rées et se cassent. On se retrouve alors avec un homogénat.
2. Centrifuga2ons différen2elles
—> voir fiche techniques moodle
On fait une première centrifuga=on ou on récupère le noyau, les organites sont présents dans le surnageant. On
prend le surnageant et on recommence jusqu’à obtenir un culot.
Avec ceSe technique on arrivera pas à séparer les microsomes, pour cela on u=lisera un gradient de densité.
3. Centrifuga2on sur gradient de densité (de saccharose)
—> voir fiche techniques moodle
On va déposer un homogénat ou un surnageant. Il va y avoir une sépara=on des organites selon leur densité.
4. Traduc2on in vitro avec ou sans microsomes
Avec un premier gradient de densité il va purifier les microsomes et avec un second gradient il va séparer les
microsomes.
Il réalise ensuite une traduc=on in vitro, il y a 2 condi=ons expérimentale :
- En absence de microsomes
- En présence de microsomes
5. Résultats
La présence des microsomes induit une coupure de la protéine.
Les protéines les plus pe=tes vont migrer plus loin dans le gel.
La protéine tronquée est-elle à l’intérieur ou à l’extérieur du microsome ?
—> diapo 11
Le test de protec2on à la protéase consiste à ajouter une protéase qui va dégrader les protéine accessible (verte et
orange). La protéine verte va être dégradée en=èrement, la protéine sera par=ellement tronquée donc elle va migrer
plus haut, elle a un coté transmembranaire.
Grace à un détergent la protéase va avoir accès à l’intérieur de la cellule. Donc tout ce qu’il y a à l’intérieur de la
cellule va être dégradé.
Donc la protéine tronquée est à l’intérieur du microsomes.
Page 2
Théorie du signal et Ré2culum Endoplasmique
TOUTES les protéines codées par le génome nucléaire commencent leur synthèse dans le cytosol.
Certaines protéines terminent leur synthèse dans le ré2culum endoplasmique.
Le RE occupe tout le volume cellulaire. La membrane externe est con=nue avec la membrane qui délimite le RE.
Où sont synthé2sées les protéines d’une cellule sécrétrice ?
Approche expérimentale : Pulse-Chase (ou marquage métabolique)
Georges PALADE a eu un prix Nobel en 1974.
Il a réalisé un pulse-chase sur des cellules de pancréas exocrine, autoradiographie, MET.
Les protéines en cours de synthèse deviennent radioac2ves. On effectue des lavages pour enlever la leucine
radioac2ve.
Ce qui nous intéresse c’est où sont fabriquées les protéines, dans le cytosol ou le RE ?
On met ensuite la tranche de pancréas sur une lamelle afin d’observer en MOT. On va ensuite observer où les grains
d’argents ce sont formés.
On observe que les grains d’agent (noirs) sont associées au ré2culum endoplasmique rugueux.
Les protéines sont donc généralement formées au niveau du RER.
I. Un signal de ciblage vers le RE a été iden2fié
Existe-t-il un contrôle du ciblage des protéines au RE ?
Approche expérimentale : Recons9tu9on in vitro du transport, vers le RE, des protéines en cours de traduc9on
G. Blodel a eu un prix Nobel en 1999
1. Lyse mécanique des cellules par la technique du PoRer
Il y a d’autres techniques comme :
- Ultra-sons
- Lyse hypotonique
- Passage par un trou d’aiguille
- Bombe à cavita=on (pression)
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Les cellules ne passent pas en en=er, elles sont é=rées et se cassent. On se retrouve alors avec un homogénat.
2. Centrifuga2ons différen2elles
—> voir fiche techniques moodle
On fait une première centrifuga=on ou on récupère le noyau, les organites sont présents dans le surnageant. On
prend le surnageant et on recommence jusqu’à obtenir un culot.
Avec ceSe technique on arrivera pas à séparer les microsomes, pour cela on u=lisera un gradient de densité.
3. Centrifuga2on sur gradient de densité (de saccharose)
—> voir fiche techniques moodle
On va déposer un homogénat ou un surnageant. Il va y avoir une sépara=on des organites selon leur densité.
4. Traduc2on in vitro avec ou sans microsomes
Avec un premier gradient de densité il va purifier les microsomes et avec un second gradient il va séparer les
microsomes.
Il réalise ensuite une traduc=on in vitro, il y a 2 condi=ons expérimentale :
- En absence de microsomes
- En présence de microsomes
5. Résultats
La présence des microsomes induit une coupure de la protéine.
Les protéines les plus pe=tes vont migrer plus loin dans le gel.
La protéine tronquée est-elle à l’intérieur ou à l’extérieur du microsome ?
—> diapo 11
Le test de protec2on à la protéase consiste à ajouter une protéase qui va dégrader les protéine accessible (verte et
orange). La protéine verte va être dégradée en=èrement, la protéine sera par=ellement tronquée donc elle va migrer
plus haut, elle a un coté transmembranaire.
Grace à un détergent la protéase va avoir accès à l’intérieur de la cellule. Donc tout ce qu’il y a à l’intérieur de la
cellule va être dégradé.
Donc la protéine tronquée est à l’intérieur du microsomes.
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