An W.
Lab 1B - Gene cloning into plasmid and
transformation of Escherichia Coli
DNA samples:
- Ligation mixture
- pUC19 plasmid DNA controle om de competentie van de cellen te bepalen
- Cells transformed with no plasmid DNA mock transformative Controle om het potentieel effect van de transformatie
reagens na te gaan. Om te checken of het resultaat dat je bekomt wel degelijk afkomstig is van het DNA en niet door de
gebruikte reagentia. Mock-getransfecteerde cellen doorlopen het transfectieproces zonder toevoeging van siRNA (d.w.z.
cellen worden alleen met transfectiereagens behandeld). Deze controle wordt gebruikt om eventuele niet-specifieke
effecten te bepalen die kunnen worden veroorzaakt door het transfectiereagens of -proces.
Procedure for the uptake of DNA
1) Cellen tijdens de log fase centrifugeren
2) Bacteriële pellet resuspenderen in CaCl2 om de celwand poreuzer te maken
3) Op ijs en aliquoteren
4) AmpR plasmid DNA toevoegen
5) Chemische competente cellen + ligatie mengsel + AmpR plasmid DNA incuberen
6) Heat shock plasmid kan erin
7) Recovery
8) Uitplaten op een LB Amp+
Onze stalen:
- Mock CC hele procedure Zonder DNA dus en zouden dus niet mogen groeien. Hoe leefbaarheid van de cellen testen?
Uitplaten op LB medium
- rec pAMP (LM)
- Mock CC voor de transformatie (voor de heat shock)
- pUC19 (lege vector)
A) Preincubation
Cellen op ijs, DNA wordt toegevoegd.
Ca2+ maskeert negatieve lading van DNA wat een Dnase resistent complex vormt. Cl - gaat in de cel en neemt H2O mee cel
gaat dus wat zwellen
B) Incubation
Cellen op ijs
C) Heat shock
Door vorming van openingen in de membraan kan het DNA naar binnen. Meteen terug op ijs.
D) Recovery
+ TYB / LB / SOC verhoogt de transformatie efficiëntie
Incubeer op 37°C met shaking noodzakelijk zodat ampiciline resistentie gen geëxpresseerd wordt
Plaat uit op antibiotic/LB platen
1
, An W.
Agar plaat Spreading scheme Wat er verwacht wordt
LB 100 l CC whole procedure 10% Mock control Om de leefbaarheid van de cellen te testen na de
transformatiestap. Hier verwachten/hopen we
groei van cellen te zien. Indien niet, dan zouden
de cellen afgedood zijn door de transformatie
reagentia. Indien er dus geen cellen groeien op
de LB plaat, wilt dit zeggen dat uw cellen dood
zijn en kan je dus ook geen transformatie of groei
verwachten op de LBAp plaat.
We verwachten hier een “lawn” aan bacteriën.
LBAp 100 l CC whole procedure 10% Mock control Hier normaal gezien geen groei aangezien de
cellen geen ampiciline resistentie gen hebben.
LBAp 100 l LM 10% + XGAL + IPTG Recombinant construct Groei van witte kolonies, minder dan bij 90%
aangezien er hier minder cellen zijn uitgeplaat.
Hier en daar ook blauwe kolonies wilt zeggen dat
er hier en daar cellen zijn die het insert niet
hebben opgenomen.
LBAp 100 l LM 90% + XGAL + IPTG Recombinant construct Groei van witte kolonies, meer dan bij 10%
aangezien er hier meer cellen zijn uitgeplaat.
Hier en daar ook blauwe kolonies wilt zeggen dat
er hier en daar cellen zijn die het insert niet
hebben opgenomen.
LB 100 l CC before procedure 10% Mock control Leefbaarheid van de cellen testen voor de
transformatiestap. Hier verwachten/hopen we
groei.
We verwachten hier een “lawn” aan bacteriën.
LBAp 100 l CC before procedure 10% Mock control Hier normaal geen groei aangezien de cellen
geen ampiciline resistentie gen hebben.
LBAp 100 l control pUC19 10% + XGAL + IPTG Control vector Groei van enkel blauwe kolonies. Enkel blauwe
kolonies te zien aangezien er een lege vector
getranfosrmeerd werd en er dus een functioneel
-galactosidase gevormd kan worden dat
vervolgens X-GAL kan hydrolyseren wat een
blauwe kleur geeft.
Aantal kolonies minder dan bij de 90% plaat.
LBAp 100 l control pUC19 90% + XGAL + IPTG Control vector Groei van enkel blauwe kolonies. Enkel blauwe
kolonies te zien aangezien er een lege vector
getranfosrmeerd werd en er dus een functioneel
-galactosidase gevormd kan worden dat
vervolgens X-GAL kan hydrolyseren wat een
blauwe kleur geeft.
Aantal kolonies meer dan bij de 10% plaat.
Zoals gezegd kunnen niet-getransformeerde cellen normaalgezien niet groeien op de LB Ap platen aangezien zij niet het
ampiciline resistentie gen bevatten. Getransformeerde cellen bevatten het ampiciline resistentie gen dat voor het enzym -
lactamase codeert. Dit enzym wordt echter extracelullair gesecreteerd door deze cellen waardoor het dus in het medium
terecht komt en hier het ampiciline vernietigt. Hierdoor kunnen niet-getransformeerde cellen toch groeien in de buurt van
getransformeerde cellen aangezien de ampiciline daar niet meer aanwezig is = Satteliet cellen
Transformatie-efficiëntie (EOT) werd in dit lab berekend uitgaande van de controle plaat met pUC19. formule
Ligatie-efficiëntie werd in dit lab bepaald aan de hand van de plaat met recombinant construct.
Bepalen v/h aantal resistente bacteriën (die vector hebben opgenomen) per microliter vloeibare cultuur: cfu/l culture.
Bij een goede ligatie set-up zou deze > 1 cfu/l of > 100 cfu/plaat indien er 100 l uitgeplaat zou zijn.
% aan blauwe kolonies: bij een goede ligatie set-up zou er minder dan 20% aan blauwe kolonies moeten zijn.
Vals positieve clones hebben geen insert, maar hebben wel het uitzicht alsof ze recombinante cellen zijn (dus ook witte
kolonies die groeien op ampiciline plaat). Valse positieve hebben in het algemeen wel een vector opgenomen, maar het
merkergen is echter geïnactiveerd door een andere gebeurtenis dan insertie van een groot DNA-fragment.
2
, An W.
Lab 2 - Analysis of pAMP
transformants by colony PCR
PCR - algemeen
1. Complementary DNA strand hybridization
2. DNA strand synthesis by DNA polymerase
Benodigdheden:
- Thermostabiel Taq DNA-polymerase
- 2 oligonucleotide primers
- 4 dNTP’s
- MgCl2
3 stappen:
1) Denaturatie
Het dubbelstrengig DNA wordt enkelstrengig gemaakt op 94°C.
2) Annealing
De primers annealen elk aan een streng op 65°C.
3) Extensie
Extensie vanaf de primers door het DNA-polymerase dat nucleotiden inbouwt en zo opnieuw dubbelstrengig DNA
verkregen wordt op 72°C.
Nadat het DNA geamplificeerd is, kan het gevisualiseerd worden d.m.v. agarose gel elektroforese. Hieruit kan nagegaan
worden of de gewenste PCR-producten aan- of afwezig zijn.
Colony PCR
Hiermee kan nagegaan worden of het insert werd opgenomen of niet.
Een individuele kolonie wordt opgepikt en getransfereerd naar de PCR-tube.
- Primers targetting vector DNA flanking the insert
Kan gebruikt worden om te bepalen of het insert de juiste grootte heeft.
- Primers specifiek voor het insert DNA
Kan gebruikt worden om te bepalen of het construct het insert DNA bevat. Deze primers zouden normaal een construct
moeten genereren van een gekende grootte. Ze kunnen dus informatie verschaffen over zowel de specificiteit als de grootte
van het insert.
- Insert specifieke primer + vector specifieke primer
Om de oriëntatie van het insert te bepalen. Er kan enkel een amplicon van een specifieke grootte verkregen worden
indien het insert in de correcte oriëntatie in de vector zit.
PCR design
Forward primer = sense primer primer in 5’3’ richting complementair aan Crick streng
Reverse primer = antisense primer primer in 3’5’ richting complementair aan Watson streng
TM en TA
TM
- 50% of the oligo and its perfect complement are in duplex
- one-half of the DNA duplex will dissociate to become single stranded
Best liggen de smelttemperaturen van beide primers in elkaars buurt (optimaal: 52-58°C)
TA
3-5°C lager dan TM
Thein en Wallace
TM = 4 x (nGC) + 2x (nAT) (°C)
TM = 64,9 + 41 x (nGC - 16,4)/n (°C)
TM = 100,5 + 16,6 x log(Na of K) + 0,41 x (%GC) - 820/n (°C)
TA << TM : aspecifieke PCR producten TA om de specificiteit te verhogen
vals positieve kan je inschatten op aantal dat je hebt en de grootte
TA >> TM : geen amplicons = vals negatieve TA om de gevoeligheid te verhogen
3
Lab 1B - Gene cloning into plasmid and
transformation of Escherichia Coli
DNA samples:
- Ligation mixture
- pUC19 plasmid DNA controle om de competentie van de cellen te bepalen
- Cells transformed with no plasmid DNA mock transformative Controle om het potentieel effect van de transformatie
reagens na te gaan. Om te checken of het resultaat dat je bekomt wel degelijk afkomstig is van het DNA en niet door de
gebruikte reagentia. Mock-getransfecteerde cellen doorlopen het transfectieproces zonder toevoeging van siRNA (d.w.z.
cellen worden alleen met transfectiereagens behandeld). Deze controle wordt gebruikt om eventuele niet-specifieke
effecten te bepalen die kunnen worden veroorzaakt door het transfectiereagens of -proces.
Procedure for the uptake of DNA
1) Cellen tijdens de log fase centrifugeren
2) Bacteriële pellet resuspenderen in CaCl2 om de celwand poreuzer te maken
3) Op ijs en aliquoteren
4) AmpR plasmid DNA toevoegen
5) Chemische competente cellen + ligatie mengsel + AmpR plasmid DNA incuberen
6) Heat shock plasmid kan erin
7) Recovery
8) Uitplaten op een LB Amp+
Onze stalen:
- Mock CC hele procedure Zonder DNA dus en zouden dus niet mogen groeien. Hoe leefbaarheid van de cellen testen?
Uitplaten op LB medium
- rec pAMP (LM)
- Mock CC voor de transformatie (voor de heat shock)
- pUC19 (lege vector)
A) Preincubation
Cellen op ijs, DNA wordt toegevoegd.
Ca2+ maskeert negatieve lading van DNA wat een Dnase resistent complex vormt. Cl - gaat in de cel en neemt H2O mee cel
gaat dus wat zwellen
B) Incubation
Cellen op ijs
C) Heat shock
Door vorming van openingen in de membraan kan het DNA naar binnen. Meteen terug op ijs.
D) Recovery
+ TYB / LB / SOC verhoogt de transformatie efficiëntie
Incubeer op 37°C met shaking noodzakelijk zodat ampiciline resistentie gen geëxpresseerd wordt
Plaat uit op antibiotic/LB platen
1
, An W.
Agar plaat Spreading scheme Wat er verwacht wordt
LB 100 l CC whole procedure 10% Mock control Om de leefbaarheid van de cellen te testen na de
transformatiestap. Hier verwachten/hopen we
groei van cellen te zien. Indien niet, dan zouden
de cellen afgedood zijn door de transformatie
reagentia. Indien er dus geen cellen groeien op
de LB plaat, wilt dit zeggen dat uw cellen dood
zijn en kan je dus ook geen transformatie of groei
verwachten op de LBAp plaat.
We verwachten hier een “lawn” aan bacteriën.
LBAp 100 l CC whole procedure 10% Mock control Hier normaal gezien geen groei aangezien de
cellen geen ampiciline resistentie gen hebben.
LBAp 100 l LM 10% + XGAL + IPTG Recombinant construct Groei van witte kolonies, minder dan bij 90%
aangezien er hier minder cellen zijn uitgeplaat.
Hier en daar ook blauwe kolonies wilt zeggen dat
er hier en daar cellen zijn die het insert niet
hebben opgenomen.
LBAp 100 l LM 90% + XGAL + IPTG Recombinant construct Groei van witte kolonies, meer dan bij 10%
aangezien er hier meer cellen zijn uitgeplaat.
Hier en daar ook blauwe kolonies wilt zeggen dat
er hier en daar cellen zijn die het insert niet
hebben opgenomen.
LB 100 l CC before procedure 10% Mock control Leefbaarheid van de cellen testen voor de
transformatiestap. Hier verwachten/hopen we
groei.
We verwachten hier een “lawn” aan bacteriën.
LBAp 100 l CC before procedure 10% Mock control Hier normaal geen groei aangezien de cellen
geen ampiciline resistentie gen hebben.
LBAp 100 l control pUC19 10% + XGAL + IPTG Control vector Groei van enkel blauwe kolonies. Enkel blauwe
kolonies te zien aangezien er een lege vector
getranfosrmeerd werd en er dus een functioneel
-galactosidase gevormd kan worden dat
vervolgens X-GAL kan hydrolyseren wat een
blauwe kleur geeft.
Aantal kolonies minder dan bij de 90% plaat.
LBAp 100 l control pUC19 90% + XGAL + IPTG Control vector Groei van enkel blauwe kolonies. Enkel blauwe
kolonies te zien aangezien er een lege vector
getranfosrmeerd werd en er dus een functioneel
-galactosidase gevormd kan worden dat
vervolgens X-GAL kan hydrolyseren wat een
blauwe kleur geeft.
Aantal kolonies meer dan bij de 10% plaat.
Zoals gezegd kunnen niet-getransformeerde cellen normaalgezien niet groeien op de LB Ap platen aangezien zij niet het
ampiciline resistentie gen bevatten. Getransformeerde cellen bevatten het ampiciline resistentie gen dat voor het enzym -
lactamase codeert. Dit enzym wordt echter extracelullair gesecreteerd door deze cellen waardoor het dus in het medium
terecht komt en hier het ampiciline vernietigt. Hierdoor kunnen niet-getransformeerde cellen toch groeien in de buurt van
getransformeerde cellen aangezien de ampiciline daar niet meer aanwezig is = Satteliet cellen
Transformatie-efficiëntie (EOT) werd in dit lab berekend uitgaande van de controle plaat met pUC19. formule
Ligatie-efficiëntie werd in dit lab bepaald aan de hand van de plaat met recombinant construct.
Bepalen v/h aantal resistente bacteriën (die vector hebben opgenomen) per microliter vloeibare cultuur: cfu/l culture.
Bij een goede ligatie set-up zou deze > 1 cfu/l of > 100 cfu/plaat indien er 100 l uitgeplaat zou zijn.
% aan blauwe kolonies: bij een goede ligatie set-up zou er minder dan 20% aan blauwe kolonies moeten zijn.
Vals positieve clones hebben geen insert, maar hebben wel het uitzicht alsof ze recombinante cellen zijn (dus ook witte
kolonies die groeien op ampiciline plaat). Valse positieve hebben in het algemeen wel een vector opgenomen, maar het
merkergen is echter geïnactiveerd door een andere gebeurtenis dan insertie van een groot DNA-fragment.
2
, An W.
Lab 2 - Analysis of pAMP
transformants by colony PCR
PCR - algemeen
1. Complementary DNA strand hybridization
2. DNA strand synthesis by DNA polymerase
Benodigdheden:
- Thermostabiel Taq DNA-polymerase
- 2 oligonucleotide primers
- 4 dNTP’s
- MgCl2
3 stappen:
1) Denaturatie
Het dubbelstrengig DNA wordt enkelstrengig gemaakt op 94°C.
2) Annealing
De primers annealen elk aan een streng op 65°C.
3) Extensie
Extensie vanaf de primers door het DNA-polymerase dat nucleotiden inbouwt en zo opnieuw dubbelstrengig DNA
verkregen wordt op 72°C.
Nadat het DNA geamplificeerd is, kan het gevisualiseerd worden d.m.v. agarose gel elektroforese. Hieruit kan nagegaan
worden of de gewenste PCR-producten aan- of afwezig zijn.
Colony PCR
Hiermee kan nagegaan worden of het insert werd opgenomen of niet.
Een individuele kolonie wordt opgepikt en getransfereerd naar de PCR-tube.
- Primers targetting vector DNA flanking the insert
Kan gebruikt worden om te bepalen of het insert de juiste grootte heeft.
- Primers specifiek voor het insert DNA
Kan gebruikt worden om te bepalen of het construct het insert DNA bevat. Deze primers zouden normaal een construct
moeten genereren van een gekende grootte. Ze kunnen dus informatie verschaffen over zowel de specificiteit als de grootte
van het insert.
- Insert specifieke primer + vector specifieke primer
Om de oriëntatie van het insert te bepalen. Er kan enkel een amplicon van een specifieke grootte verkregen worden
indien het insert in de correcte oriëntatie in de vector zit.
PCR design
Forward primer = sense primer primer in 5’3’ richting complementair aan Crick streng
Reverse primer = antisense primer primer in 3’5’ richting complementair aan Watson streng
TM en TA
TM
- 50% of the oligo and its perfect complement are in duplex
- one-half of the DNA duplex will dissociate to become single stranded
Best liggen de smelttemperaturen van beide primers in elkaars buurt (optimaal: 52-58°C)
TA
3-5°C lager dan TM
Thein en Wallace
TM = 4 x (nGC) + 2x (nAT) (°C)
TM = 64,9 + 41 x (nGC - 16,4)/n (°C)
TM = 100,5 + 16,6 x log(Na of K) + 0,41 x (%GC) - 820/n (°C)
TA << TM : aspecifieke PCR producten TA om de specificiteit te verhogen
vals positieve kan je inschatten op aantal dat je hebt en de grootte
TA >> TM : geen amplicons = vals negatieve TA om de gevoeligheid te verhogen
3
