Deel1: weefselleer/ histologie
1. Inleiding
• DEF: is een tak van de biologie die de normale microscopische structuur/vorm van levende
organismen in relatie tot haar functie bestudeert
• Morfologische wetenschap
• 4 niveaus volgens structurele eenheid
o Cytologie/ celbiologie
▪ Kleinste structurele eenheid
▪ Studie celvorm, celfunctie
▪ Elektronenmicroscoop
o Algemene histologie
▪ Studie weefsels
▪ Weefsel: verzameling gelijksoortige cellen
gezamenlijke functie
▪ Lichtmicroscopie
▪ 4 soorten
❖ Epitheel
❖ Bind- en steunweefsel
❖ Spierweefsel
❖ Zenuwweefsel
o Bijzondere histologie of microscopische anatomie
▪ Studie organen
▪ Orgaan: 2 of meer weefsels
▪ Groep organen samenwerken→ 1 specifieke lichaamsfunctie
= orgaansysteem/ orgaanstelsel
2. Histologische technieken
• = manier weefsels(LM), organen(LM), cellen (EM) observeerbaar maken voor licht- en
elektronenmicroscopie
• Weefsel te dik (!probleem)
o Laat weinig licht/ elektronen door
o Weinig contrast in biologisch materiaal
1. Prepareren van histologisch materiaal
Verschillende stappen
1. Fixatie
• Doel: oorspronkelijke structuur cel vastleggen/bewaren → nadien geen verandering
Denatureren celproteïnen (stap 1)
→stilleggen bacteriële en autolytische afbraakreacties
(ook mogelijk: crosslinken bv. Formaldehyde)
o Chemische fixatie
▪ Denatureren via fixator
▪ Bv. Ethanol(+), azijnzuur, glutaaraldehyde(EM), formaldehyde,…
1
, o Koude fixatie
o Denatureren via invriezen vezels
• Permeabiliseren celmembraan
o Zeef maken→ doorlaatbaar weefsel voor stoffen (bv. Kleurstof)
• Harder en poreuzer maken
➔ Makkelijk snijden
• Nadelen fixators
o Bv. Zwelling azijnzuur, neerslag alcohol,…
o Oplossing: mengsel fixators
2. Inbedden
• = in iets groters brengen mbv inbedmiddel
• Inbedmiddel
o Substantie die in weefsel doordringt
o Vast (atomen polymeriseren)→ vloeibaar→ hard
• Doel: materiaal snijdbaar (hard)→ dunne plakken (coupes)
• Hoe harder inbedmiddel hoe dunner coupes
• Inbedmiddel LM
o Paraffine & celloïdine
▪ Snijden: stalen mes microtoom
o Harsen & acrylaatpolymeren
▪ Dunnere coupes (= halfdunne)
▪ Snijden: glazen mes microtoom
• Inbedmiddel EM
o Epoxyhars
▪ Zeer dunne coupes
▪ Glasmessen/ diamantmessen
Opmerking!
o Inbedmiddel = hydrofoob
o Weefsel bevat veel water
➔ Weefsel ontwateren
▪ Weefsel in stijgende reeks alcoholbaden brengen
▪ 30° - 50°- 70°- 90°- 100° ethanol
➔ Clearing in tolueen
▪ Reden: paraffine en alcohol mengen niet
3. Kleuren (LM)
• Wit licht (microscoop) → weefsel zichtbaar
o Spectrum golflengtes→ ontstaan kleurverschillen (door verschil lichtabsorptie)
• Celbestanddelen en intercellulair materiaal visualiseren + contrast
• Kleurstoffen: waterige oplossing (vaak)
• Voor kleuren: deparaffineren
o Paraffine eruit→ water
o Reden: binden met kleurstof
1. Zure en basische kleurstoffen
• Door denaturatie (zie fixatie)→ in weefsel: vrijkomen zure (-) en basische (+) groepen
o Zure groep: H+ ionen afgeven
2
, o Basische groep: H+ ionen opnemen
• Richting evenwichtsreacties bepaald door pH kleuroplossing
o Isoelectrisch punt= evenveel zuren en basen
• Weefsels bevatten amfolieten (basische (cytoplasma of eiwitten) en zure (DNA) groep)
• Kleurstof
o Elk kleurstof→ 2 delen
▪ Chromofoor
❖ kleurendrager
▪ auxochroom
❖ hydrofiel→ kleurstof wateroplosbaar
❖ bindt chromofoor aan weefsel
o kationische kleurstof (+)
▪ = basische kleurstof
▪ Reageren met zure weefselbestanden
▪ Bv. Haematoxyline (= base)
▪ Blauwe kleur
o Anionische kleurstof (-)
▪ = zure kleurstof
▪ Reageren met basische weefselbestanden
▪ Bv. Eosine (=zuur)
▪ Roze kleur
• Basofiel: weefselcomponent reageert met kationische kleurstof
• Eosinofiel: weefselcomponent reageert met anionische kleurstof
2. Indifferente kleurstoffen
• Koolhydraten/ suikers
o Polysachariden, enkelvoudig/ samengesteld vetcel
o Gebonden met complexe molecule (vaak)
o Slecht kleurbaar→ oplos: metachromasie
• Vetten/lipiden
o Vetten lossen op in alcohol→ weinig kleurbaar
o Neutrale vetten
▪ kleurbaar met vetoplosbare kleurstoffen
▪ bv. Soudan black
o EM
▪ Celmembraan zichtbaar
Metachromasie
• Bepaalde kleurstoffen (bv. Toluïdine blauw) kleuren weefsel niet dezelfde kleur als in
waterige oplossing (blauw) → maar rood/ paarse kleur
• Reden kleurstofverandering: vormen dimeren tussen kleurstofmoleculen
• Bv: zure glycosaminoglycanen in kraakbeen
Histochemische kleuringen en technieken
= identificatie en lokalisatie van specifieke chemische groepen in cellen en weefsels
• Feulgen kleuring: DNA
• Enzymkleuring: aantonen activiteit enzym
o Via substraat (kleurmolecule)→ enzym gaat het afbreken= activiteit aantonen
• PAS-reactie: Periodic Acid Schiff
3
, o Aantonen glycogeen
o Werking: glycogeengroepen kleuren→
omzetten aldehyde→ contact schiff→ roze
• Immunohistochemische kleurtechniek
o Antilichamen: antistoffen door lichaam
aangemaakt wanneer er onbekende moleculen
zich in het lichaam bevinden
o Antilichamen binden antigene plaatsen= AG-AL complex
o Antilichaam voorzien van merker
o Voor: LM EM FM
• In Stitu Hybridisatie
o Specifieke sequenties (bv; nucleïnezuur) DNA/RNA zichtbaar maken
o Werking
▪ Gelabeld probe + doelwitnucleïnezuur(= target→ nucleïnezuursequentie
lokaliseren) denatureren→ moleculen enkelstrengig
▪ Enkelstrengige probe + complementaire sequentie in target→ hybride =
hybridisatie
▪ Via gelabelde probes→ geïnteresseerde sequentie visualiseren
o Bv. bepaalde mutatie die voorkomt visualiseren
o Fluorescentiemicroscopie (FM)
▪ Filters toevoegen →geen wit licht meer
→bepaalde golflengte licht doorlaten
▪ Gebruik fluorescerende kleurstoffen of fluorochromen
❖ Bestralen licht kortere golflengte→ oplichten
▪ Bv. visualiseren thymidine in DNA
Autohistoradiografie
• Histologische techniek→ visualiseren metabolische activiteit
4. Contrasteren (EM)
• Kleuren→ contrasteren
• Beeldcontrast: elektronenstrooiing op atomen doorstraald weefsel
• LM weinig densiteitverschillen
• Elektronenstrooiing ↗ toevoegen zware metalen (binden op eiwitten, vetten,…→é niet
door→ meer contrast) => verhogen densiteitverschillen
• ↗elektronenstrooiing→ ↗contrast
• Fluorescentiescherm/ fotografische plaat
o Beeldvorming:
▪ Ontstaan door verschillen elektronenstrooiing op atomen doorstraald
weefsel
▪ Elektronenstrooiing afh. Atoomnummer kan ↗ toevoegen zware metalen
▪ É erdoor→ fotografische plaat belichten(neg)→ beeld (pos)
▪ É niet → fotografische plaat niet belichten(neg)→ geen beeld/ donker
element= e-strooiende/ e-dense gebieden (pos)
2. Observatiemethoden
1. Lichtmicroscopie
• Beeldvorming
4
1. Inleiding
• DEF: is een tak van de biologie die de normale microscopische structuur/vorm van levende
organismen in relatie tot haar functie bestudeert
• Morfologische wetenschap
• 4 niveaus volgens structurele eenheid
o Cytologie/ celbiologie
▪ Kleinste structurele eenheid
▪ Studie celvorm, celfunctie
▪ Elektronenmicroscoop
o Algemene histologie
▪ Studie weefsels
▪ Weefsel: verzameling gelijksoortige cellen
gezamenlijke functie
▪ Lichtmicroscopie
▪ 4 soorten
❖ Epitheel
❖ Bind- en steunweefsel
❖ Spierweefsel
❖ Zenuwweefsel
o Bijzondere histologie of microscopische anatomie
▪ Studie organen
▪ Orgaan: 2 of meer weefsels
▪ Groep organen samenwerken→ 1 specifieke lichaamsfunctie
= orgaansysteem/ orgaanstelsel
2. Histologische technieken
• = manier weefsels(LM), organen(LM), cellen (EM) observeerbaar maken voor licht- en
elektronenmicroscopie
• Weefsel te dik (!probleem)
o Laat weinig licht/ elektronen door
o Weinig contrast in biologisch materiaal
1. Prepareren van histologisch materiaal
Verschillende stappen
1. Fixatie
• Doel: oorspronkelijke structuur cel vastleggen/bewaren → nadien geen verandering
Denatureren celproteïnen (stap 1)
→stilleggen bacteriële en autolytische afbraakreacties
(ook mogelijk: crosslinken bv. Formaldehyde)
o Chemische fixatie
▪ Denatureren via fixator
▪ Bv. Ethanol(+), azijnzuur, glutaaraldehyde(EM), formaldehyde,…
1
, o Koude fixatie
o Denatureren via invriezen vezels
• Permeabiliseren celmembraan
o Zeef maken→ doorlaatbaar weefsel voor stoffen (bv. Kleurstof)
• Harder en poreuzer maken
➔ Makkelijk snijden
• Nadelen fixators
o Bv. Zwelling azijnzuur, neerslag alcohol,…
o Oplossing: mengsel fixators
2. Inbedden
• = in iets groters brengen mbv inbedmiddel
• Inbedmiddel
o Substantie die in weefsel doordringt
o Vast (atomen polymeriseren)→ vloeibaar→ hard
• Doel: materiaal snijdbaar (hard)→ dunne plakken (coupes)
• Hoe harder inbedmiddel hoe dunner coupes
• Inbedmiddel LM
o Paraffine & celloïdine
▪ Snijden: stalen mes microtoom
o Harsen & acrylaatpolymeren
▪ Dunnere coupes (= halfdunne)
▪ Snijden: glazen mes microtoom
• Inbedmiddel EM
o Epoxyhars
▪ Zeer dunne coupes
▪ Glasmessen/ diamantmessen
Opmerking!
o Inbedmiddel = hydrofoob
o Weefsel bevat veel water
➔ Weefsel ontwateren
▪ Weefsel in stijgende reeks alcoholbaden brengen
▪ 30° - 50°- 70°- 90°- 100° ethanol
➔ Clearing in tolueen
▪ Reden: paraffine en alcohol mengen niet
3. Kleuren (LM)
• Wit licht (microscoop) → weefsel zichtbaar
o Spectrum golflengtes→ ontstaan kleurverschillen (door verschil lichtabsorptie)
• Celbestanddelen en intercellulair materiaal visualiseren + contrast
• Kleurstoffen: waterige oplossing (vaak)
• Voor kleuren: deparaffineren
o Paraffine eruit→ water
o Reden: binden met kleurstof
1. Zure en basische kleurstoffen
• Door denaturatie (zie fixatie)→ in weefsel: vrijkomen zure (-) en basische (+) groepen
o Zure groep: H+ ionen afgeven
2
, o Basische groep: H+ ionen opnemen
• Richting evenwichtsreacties bepaald door pH kleuroplossing
o Isoelectrisch punt= evenveel zuren en basen
• Weefsels bevatten amfolieten (basische (cytoplasma of eiwitten) en zure (DNA) groep)
• Kleurstof
o Elk kleurstof→ 2 delen
▪ Chromofoor
❖ kleurendrager
▪ auxochroom
❖ hydrofiel→ kleurstof wateroplosbaar
❖ bindt chromofoor aan weefsel
o kationische kleurstof (+)
▪ = basische kleurstof
▪ Reageren met zure weefselbestanden
▪ Bv. Haematoxyline (= base)
▪ Blauwe kleur
o Anionische kleurstof (-)
▪ = zure kleurstof
▪ Reageren met basische weefselbestanden
▪ Bv. Eosine (=zuur)
▪ Roze kleur
• Basofiel: weefselcomponent reageert met kationische kleurstof
• Eosinofiel: weefselcomponent reageert met anionische kleurstof
2. Indifferente kleurstoffen
• Koolhydraten/ suikers
o Polysachariden, enkelvoudig/ samengesteld vetcel
o Gebonden met complexe molecule (vaak)
o Slecht kleurbaar→ oplos: metachromasie
• Vetten/lipiden
o Vetten lossen op in alcohol→ weinig kleurbaar
o Neutrale vetten
▪ kleurbaar met vetoplosbare kleurstoffen
▪ bv. Soudan black
o EM
▪ Celmembraan zichtbaar
Metachromasie
• Bepaalde kleurstoffen (bv. Toluïdine blauw) kleuren weefsel niet dezelfde kleur als in
waterige oplossing (blauw) → maar rood/ paarse kleur
• Reden kleurstofverandering: vormen dimeren tussen kleurstofmoleculen
• Bv: zure glycosaminoglycanen in kraakbeen
Histochemische kleuringen en technieken
= identificatie en lokalisatie van specifieke chemische groepen in cellen en weefsels
• Feulgen kleuring: DNA
• Enzymkleuring: aantonen activiteit enzym
o Via substraat (kleurmolecule)→ enzym gaat het afbreken= activiteit aantonen
• PAS-reactie: Periodic Acid Schiff
3
, o Aantonen glycogeen
o Werking: glycogeengroepen kleuren→
omzetten aldehyde→ contact schiff→ roze
• Immunohistochemische kleurtechniek
o Antilichamen: antistoffen door lichaam
aangemaakt wanneer er onbekende moleculen
zich in het lichaam bevinden
o Antilichamen binden antigene plaatsen= AG-AL complex
o Antilichaam voorzien van merker
o Voor: LM EM FM
• In Stitu Hybridisatie
o Specifieke sequenties (bv; nucleïnezuur) DNA/RNA zichtbaar maken
o Werking
▪ Gelabeld probe + doelwitnucleïnezuur(= target→ nucleïnezuursequentie
lokaliseren) denatureren→ moleculen enkelstrengig
▪ Enkelstrengige probe + complementaire sequentie in target→ hybride =
hybridisatie
▪ Via gelabelde probes→ geïnteresseerde sequentie visualiseren
o Bv. bepaalde mutatie die voorkomt visualiseren
o Fluorescentiemicroscopie (FM)
▪ Filters toevoegen →geen wit licht meer
→bepaalde golflengte licht doorlaten
▪ Gebruik fluorescerende kleurstoffen of fluorochromen
❖ Bestralen licht kortere golflengte→ oplichten
▪ Bv. visualiseren thymidine in DNA
Autohistoradiografie
• Histologische techniek→ visualiseren metabolische activiteit
4. Contrasteren (EM)
• Kleuren→ contrasteren
• Beeldcontrast: elektronenstrooiing op atomen doorstraald weefsel
• LM weinig densiteitverschillen
• Elektronenstrooiing ↗ toevoegen zware metalen (binden op eiwitten, vetten,…→é niet
door→ meer contrast) => verhogen densiteitverschillen
• ↗elektronenstrooiing→ ↗contrast
• Fluorescentiescherm/ fotografische plaat
o Beeldvorming:
▪ Ontstaan door verschillen elektronenstrooiing op atomen doorstraald
weefsel
▪ Elektronenstrooiing afh. Atoomnummer kan ↗ toevoegen zware metalen
▪ É erdoor→ fotografische plaat belichten(neg)→ beeld (pos)
▪ É niet → fotografische plaat niet belichten(neg)→ geen beeld/ donker
element= e-strooiende/ e-dense gebieden (pos)
2. Observatiemethoden
1. Lichtmicroscopie
• Beeldvorming
4
