VIROLOGIE
H7: LABORATORIUMTECHNIEKEN IN DE VIROLOGIE
INLEIDING
1. Aantonen van virus of virusantigenen in preparaat van patiëntenmateriaal
- Lichtmicroscopisch
- Via immunologische technieken
- Door moleculaire diagnostiek: aanwezigheid viraal genoom aantonen
2. Isolatie van het virus uit patiëntenmateriaal
Zo vroeg mogelijk na begin van ziekte omdat het virus dreigt te verdwijnen wanneer de immuniteit
zich ontwikkelt.
+ Identificatie en typering van het geïsoleerde virus met specifieke antisera
Aanwezige bacteriën/celresten uit de levende cellen verwijderen door te verdunnen, te
centrifugeren of te filtreren. Dan pas virus laten repliceren in levende cellen via celkweek, want in
geschikt patiëntenmateriaal is er dus nog levend virus aanwezig. Dan voegt men voor de typering een
specifiek AL-mengsel toe om de AG aan te tonen.
3. Aantonen van AL-vorming = serologische diagnose
- Stijging AL-titer
- Virusspecifieke IgM → primaire of recente infectie
1
,ZUIVERING EN AANCONCENTRATIE VAN VIRUSSEN
Vermits viruskweek gebeurt a.d.h.v. levende cellen is het nodig het virus te scheiden van
celfragmenten en ander niet-viraal materiaal. Dit kan op meerdere manieren:
1. Differentieel centrifugeren:
o Eerst laag toerental → grote partikels neerslaan
o Dan hoog toerental en lang → virussen neerslaan
2. Filtratie
o Filters met poriën die cellen, celresten en bacteriën tegenhouden maar niet virussen.
3. Evenwichtscentrifugatie
o Concentratiegradiënt van een oplossing in een centrifugeerbuisje inbrengen
o Virusbevattend staal toevoegen en centrifugeren
o Virus wordt naargelang de dichtheid en grootte op bepaalde plaats in de buis
teruggevonden
a) Om de deeltjes te scheiden
Sucrose oplossing → 2 lagen: een laag van 20% sucrose en een laag van 5% sucrose+ staal met daarin
restjes van cellen en virussen toevoegen (hier DNA staal). Dan centrifugeren.
Evenwichtscentrifugatie: staal gaat naargelang de grootte zich gaan verdelen over die verschillende
lagen. In geval van DNA zullen de grote partikels onderaan zitten.
b) Mengeling van deeltjes → centrifugeren
naargelang de afmetingen van het virus en de vorm, gaan de grote partikels meer beneden zitten. De
kleine partikels meer bovenaan (hier wellicht virussen). Celresten zitten op de bodem. Als je
voldoende fracties neemt dan heb je eerste fracties waar er niets is, dan een beetje celresten, dan
volledig de celresten, dan ertussen niets, dan zoveel mogelijk virusmateriaal.
2
,BEPALING VAN DE AFMETING VAN VIRUSSEN
Men kan de afmeting van virussen bepalen als hulpmiddel voor de identificatie van onbekende
virussen. Methodes:
- Filtratie: filtreren door verschillende filtreermembranen met gekende poriëndiameter
- Sedimentatie in een ultracentrifuge: sedimentatiesnelheid is afhankelijk van de massa van
het deeltje (hoe zwaarder, hoe sneller) en de vorm van het virus (sferisch: minder wrijving
dan staafvormig)
- Elektronenmicroscopisch: afmetingen en vorm van viruspartikel heel nauwkeurig bepaald
- Fluorescentiemicroscopisch: nog nauwkeuriger
KWEKEN VAN VIRUSSEN
Aangezien virussen altijd obligaat intracellulaire parasieten zijn, zal men over levende cellen moeten
beschikken om virussen te kweken of hun aanwezigheid tonen. Virussen hebben in de regel
specifieke eisen ten aanzien van de cellen waarin ze kunnen groeien.
1. Proefdieren
- Rhesusaapje: reageren vaak op dezelfde manier als mensen
- Specifieke muizen: om bepaalde proeven aan te tonen
- Albinokonijnen
- Albinoratten
- Cavia’s = guinea pig
- Witte muizen: ontbreken een of ander gen
Vroeger werden proefdieren meer gebruikt. Het werd dan gebruikt voor poliomyelitisvirus te kweken
op apen (nu weefselkweek). Ook het Coxsackie A-virus wordt nog steeds op pasgeboren muisjes
gekweekt. De aanwezigheid van virus kan aangetoond worden door ziekte of dood van het dier. Toch
proberen we de 3V’s toe te passen.
2. Kippenembryo’s
Men ontdekte dat verschillende virussen zich in de embryonale
weefsels van het bebroede kippenei konden ontwikkelen.
Embryonale weefsels reageren niet of minder tegen infectie, er is
bovendien geen immuniteitsreactie waardoor virussen
ongestoord kunnen repliceren. Het virusbevattende materiaal
wordt ingespoten, na 7-12 dagen, in de allantoisholte (vuilbak),
de amniosholte (vruchtwater) of de dooierzak (voeding voor
kippenembryo). Men kan ook inoculeren in de membraan (tussen
allantoisholte en chorionmembraan). Dit wordt dan ook het
meest gebruikt omdat het best beschikbaar is.
Er wordt gebruik soms gemaakt van licht (warmte). Hierdoor kan men ook de kippenembryo
doorheen het ei zelf zien → markering waar embryo zit voor injectie.
Productieproces van een griepvaccin
3
, Eerst bepaalt en selecteert men het virus. Griepvirussen veranderen elk jaar door antigenic drift,
waardoor elk jaar een nieuw vaccin nodig is. de WHO bepaalt de virusstam in het vaccin. Dan gebeurt
de virusinoculatie in kippenembryo’s, waardoor de virussen kunnen vermenigvuldigen op grote
schaal. (Bij Solvay kweekte men vroeger 700.000 eieren per week.) Daarna desactiveert men het
virus. De volgende stap is de selectie van bepaalde virusproteïnen, gevolgd door de purificatie
(opzuivering = ontdaan worden van celfragmenten en storende componenten) en de formulering van
het finale vaccin. Tenslotte vult men de injectienaalden en verpakt het geheel.
Nadelen productie in eieren:
- Mogelijk allergische reacties: 5% van de wereldbevolking is allergisch aan eiproteïnes (komen
via het productieproces in het vaccin terecht)
- Eieren moeten lang op voorhand besteld worden → opstart productieproces is vrij lang
- Kwaliteit is niet altijd even constant
Alternatieve productieproces: Solvay heeft de eieren vervangen door cellen in celkweek. Voordelen
hiervan zijn:
- Hogere constante kwaliteit
- Cellen zijn altijd in voorraad → proces kan snel opgestart worden
- Product leidt niet tot allergische reacties
Recombinant vaccins: genen voor HA ingebracht in virus dat vermenigvuldigt in insecten (USA).
Vaccin tegen griep in België: GSK
Pandemische influenza vaccin. Elke 0,5ml dosis: geïnactiveerd, afgesplitst influenza virusantigeen.
Voordeel van pandemerix is dat er een adjuvans is toegevoegd (brengt AL reactie op gang), nl
squaleen, waardoor er maar 1 vaccinatie nodig is.
Vaccin tegen griep in België: contra-indicaties
Tegenaanwijzigingen: allergie aan 1 van de producten, of 1 van de contaminatieresten (formol,
gentamicine AB, natrium deoxycholaat)
Risico’s vaccinatie tegen Mexicaanse griep?
- Gefabriceerd volgens procedé GSK idem als seizoensgriep (wel in eieren)
- Gecontroleerde studies > 11.000 personen: procedé veilig
- + hulpstoffen (niet toxisch)
- In de gaten blijven houden
- Dec 2011: bewezen meer narcolepsie reacties bij kinderen. Guilain-Barré nog niet bewezen.
o Slaperigheid overdag
o Guillain-barré = vorm van neuropathie → perifere zenuwaandoening waarbij axonen
degeneren en demyelinisatie optreedt (tintelingen en gevoelsverlies)
4
H7: LABORATORIUMTECHNIEKEN IN DE VIROLOGIE
INLEIDING
1. Aantonen van virus of virusantigenen in preparaat van patiëntenmateriaal
- Lichtmicroscopisch
- Via immunologische technieken
- Door moleculaire diagnostiek: aanwezigheid viraal genoom aantonen
2. Isolatie van het virus uit patiëntenmateriaal
Zo vroeg mogelijk na begin van ziekte omdat het virus dreigt te verdwijnen wanneer de immuniteit
zich ontwikkelt.
+ Identificatie en typering van het geïsoleerde virus met specifieke antisera
Aanwezige bacteriën/celresten uit de levende cellen verwijderen door te verdunnen, te
centrifugeren of te filtreren. Dan pas virus laten repliceren in levende cellen via celkweek, want in
geschikt patiëntenmateriaal is er dus nog levend virus aanwezig. Dan voegt men voor de typering een
specifiek AL-mengsel toe om de AG aan te tonen.
3. Aantonen van AL-vorming = serologische diagnose
- Stijging AL-titer
- Virusspecifieke IgM → primaire of recente infectie
1
,ZUIVERING EN AANCONCENTRATIE VAN VIRUSSEN
Vermits viruskweek gebeurt a.d.h.v. levende cellen is het nodig het virus te scheiden van
celfragmenten en ander niet-viraal materiaal. Dit kan op meerdere manieren:
1. Differentieel centrifugeren:
o Eerst laag toerental → grote partikels neerslaan
o Dan hoog toerental en lang → virussen neerslaan
2. Filtratie
o Filters met poriën die cellen, celresten en bacteriën tegenhouden maar niet virussen.
3. Evenwichtscentrifugatie
o Concentratiegradiënt van een oplossing in een centrifugeerbuisje inbrengen
o Virusbevattend staal toevoegen en centrifugeren
o Virus wordt naargelang de dichtheid en grootte op bepaalde plaats in de buis
teruggevonden
a) Om de deeltjes te scheiden
Sucrose oplossing → 2 lagen: een laag van 20% sucrose en een laag van 5% sucrose+ staal met daarin
restjes van cellen en virussen toevoegen (hier DNA staal). Dan centrifugeren.
Evenwichtscentrifugatie: staal gaat naargelang de grootte zich gaan verdelen over die verschillende
lagen. In geval van DNA zullen de grote partikels onderaan zitten.
b) Mengeling van deeltjes → centrifugeren
naargelang de afmetingen van het virus en de vorm, gaan de grote partikels meer beneden zitten. De
kleine partikels meer bovenaan (hier wellicht virussen). Celresten zitten op de bodem. Als je
voldoende fracties neemt dan heb je eerste fracties waar er niets is, dan een beetje celresten, dan
volledig de celresten, dan ertussen niets, dan zoveel mogelijk virusmateriaal.
2
,BEPALING VAN DE AFMETING VAN VIRUSSEN
Men kan de afmeting van virussen bepalen als hulpmiddel voor de identificatie van onbekende
virussen. Methodes:
- Filtratie: filtreren door verschillende filtreermembranen met gekende poriëndiameter
- Sedimentatie in een ultracentrifuge: sedimentatiesnelheid is afhankelijk van de massa van
het deeltje (hoe zwaarder, hoe sneller) en de vorm van het virus (sferisch: minder wrijving
dan staafvormig)
- Elektronenmicroscopisch: afmetingen en vorm van viruspartikel heel nauwkeurig bepaald
- Fluorescentiemicroscopisch: nog nauwkeuriger
KWEKEN VAN VIRUSSEN
Aangezien virussen altijd obligaat intracellulaire parasieten zijn, zal men over levende cellen moeten
beschikken om virussen te kweken of hun aanwezigheid tonen. Virussen hebben in de regel
specifieke eisen ten aanzien van de cellen waarin ze kunnen groeien.
1. Proefdieren
- Rhesusaapje: reageren vaak op dezelfde manier als mensen
- Specifieke muizen: om bepaalde proeven aan te tonen
- Albinokonijnen
- Albinoratten
- Cavia’s = guinea pig
- Witte muizen: ontbreken een of ander gen
Vroeger werden proefdieren meer gebruikt. Het werd dan gebruikt voor poliomyelitisvirus te kweken
op apen (nu weefselkweek). Ook het Coxsackie A-virus wordt nog steeds op pasgeboren muisjes
gekweekt. De aanwezigheid van virus kan aangetoond worden door ziekte of dood van het dier. Toch
proberen we de 3V’s toe te passen.
2. Kippenembryo’s
Men ontdekte dat verschillende virussen zich in de embryonale
weefsels van het bebroede kippenei konden ontwikkelen.
Embryonale weefsels reageren niet of minder tegen infectie, er is
bovendien geen immuniteitsreactie waardoor virussen
ongestoord kunnen repliceren. Het virusbevattende materiaal
wordt ingespoten, na 7-12 dagen, in de allantoisholte (vuilbak),
de amniosholte (vruchtwater) of de dooierzak (voeding voor
kippenembryo). Men kan ook inoculeren in de membraan (tussen
allantoisholte en chorionmembraan). Dit wordt dan ook het
meest gebruikt omdat het best beschikbaar is.
Er wordt gebruik soms gemaakt van licht (warmte). Hierdoor kan men ook de kippenembryo
doorheen het ei zelf zien → markering waar embryo zit voor injectie.
Productieproces van een griepvaccin
3
, Eerst bepaalt en selecteert men het virus. Griepvirussen veranderen elk jaar door antigenic drift,
waardoor elk jaar een nieuw vaccin nodig is. de WHO bepaalt de virusstam in het vaccin. Dan gebeurt
de virusinoculatie in kippenembryo’s, waardoor de virussen kunnen vermenigvuldigen op grote
schaal. (Bij Solvay kweekte men vroeger 700.000 eieren per week.) Daarna desactiveert men het
virus. De volgende stap is de selectie van bepaalde virusproteïnen, gevolgd door de purificatie
(opzuivering = ontdaan worden van celfragmenten en storende componenten) en de formulering van
het finale vaccin. Tenslotte vult men de injectienaalden en verpakt het geheel.
Nadelen productie in eieren:
- Mogelijk allergische reacties: 5% van de wereldbevolking is allergisch aan eiproteïnes (komen
via het productieproces in het vaccin terecht)
- Eieren moeten lang op voorhand besteld worden → opstart productieproces is vrij lang
- Kwaliteit is niet altijd even constant
Alternatieve productieproces: Solvay heeft de eieren vervangen door cellen in celkweek. Voordelen
hiervan zijn:
- Hogere constante kwaliteit
- Cellen zijn altijd in voorraad → proces kan snel opgestart worden
- Product leidt niet tot allergische reacties
Recombinant vaccins: genen voor HA ingebracht in virus dat vermenigvuldigt in insecten (USA).
Vaccin tegen griep in België: GSK
Pandemische influenza vaccin. Elke 0,5ml dosis: geïnactiveerd, afgesplitst influenza virusantigeen.
Voordeel van pandemerix is dat er een adjuvans is toegevoegd (brengt AL reactie op gang), nl
squaleen, waardoor er maar 1 vaccinatie nodig is.
Vaccin tegen griep in België: contra-indicaties
Tegenaanwijzigingen: allergie aan 1 van de producten, of 1 van de contaminatieresten (formol,
gentamicine AB, natrium deoxycholaat)
Risico’s vaccinatie tegen Mexicaanse griep?
- Gefabriceerd volgens procedé GSK idem als seizoensgriep (wel in eieren)
- Gecontroleerde studies > 11.000 personen: procedé veilig
- + hulpstoffen (niet toxisch)
- In de gaten blijven houden
- Dec 2011: bewezen meer narcolepsie reacties bij kinderen. Guilain-Barré nog niet bewezen.
o Slaperigheid overdag
o Guillain-barré = vorm van neuropathie → perifere zenuwaandoening waarbij axonen
degeneren en demyelinisatie optreedt (tintelingen en gevoelsverlies)
4
