Laboratory tools
Les 1: Basisbegrippen voor scheidingsmethoden, gelfiltratie en
affiniteitschromatografie
Chromatografie is een methode om stoffen van elkaar te scheiden. In deze les gaat het
specifiek om het scheiden van eiwitten. Chromatografie kan worden onderverdeeld in twee
typen; preparatief en analytisch. Bij preparatief wil je een specifiek stofje overhouden. Bij
analytisch wil je weten waaruit je mengsel bestaat.
Bij chromatografie zijn er twee ‘’onderdelen’’: de stationaire fase en de mobiele fase. De
stationaire fase is vast en de mobiele fase is vloeibaar en loopt langs de stationaire fase. De
twee fasen mengen niet met elkaar. De moleculen in de stationaire fase gaan interacties aan
met de moleculen in de mobiele fase. Als een molecuul in de mobiele fase geen bindingen
aan kan gaan met moleculen in de stationaire fase, loopt het snel van de kolom af. De
stoffen die we van elkaar willen scheiden door middel van chromatografie lopen niet met
dezelfde snelheid over de kolom.
Kolomchromatografie is een soort chromatografisch systeem. Bij kolomchromatografie is er
een probleem; de diffusie. Er gaat namelijk variatie ontstaan tussen het moment dat de
moleculen van de kolom afkomen, dit gebeurt als het scheiden langer duurt. Je wilt dus
eigenlijk zo snel mogelijk de stoffen over de kolom heen laten lopen. Om daarbij te helpen
worden vaak pompen gebruikt die ervoor zorgen dat de stoffen sneller over de kolom heen
lopen. Er zijn daarvan twee soorten systemen; HPLC en FPLC. Het verschil van deze
soorten is dat bij HPLC de druk veel hoger is, dit systeem wordt daarom vooral gebruikt bij
kleine biologische moleculen. Bij FPLC is de druk lager, dit systeem wordt daarom gebruikt
bij grotere moleculen. FPLC is dus beter voor het scheiden van eiwitten, omdat de eiwitten
niet kapot worden gemaakt.
In de meeste gevallen is de stationaire fase vast en de mobiele fase vloeibaar. Bij
gaschromatografie is de mobiele fase gasvormig, dit wordt in de life sciences niet veel
gebruikt.
In het chromatografische systeem zit tussen de kolom en de buizen een detector. Deze
stuurt signalen door naar een computer. Op de computer is dan een grafiek te zien met
pieken. UV kan aminozuren detecteren en wanneer er een piek bij UV zit, betekent het dat
er eiwitten van de kolom afkomen. Uit zo’n chromatogram kun je veel informatie halen zoals:
- De dode tijd (T0,V0). De dode tijd is hoeveel tijd (of volume) er nodig is voor de
mobiele fase om de kolom te verlaten.
- De retentietijd (Tr) is de tijd tussen het injecteren van het monster en het midden van
de piek van het eluaat. De netto retentietijd is Tr - T0. Stoffen met een langere
retentietijd binden beter aan de kolom.
- De piekhoogte vertelt iets over hoeveel van een stof in je mengsel zit.
, - De breedte van de piek (W) geeft de diffusie aan. Hoe meer verschil in tijd (meer
diffusie), hoe breder de piek. Je wilt dus een smalle piek, want dan is de scheiding
beter. De pieken moeten elkaar niet overlappen.
- De selectiviteit (α) zegt iets over hoe ver de pieken uit elkaar
liggen. Hoe groter de selectiviteit, hoe beter de scheiding.
- De resolutie (R) is het verschil tussen de pieken in verhouding tot
de breedte ervan.
- De efficiëntie is een maat voor de hoeveelheid pieken die je kan
hebben in een kolom, ook wel het schotelgetal.
Als de resolutie groter is dan 1 liggen de pieken goed van elkaar af en zijn de eiwitten
(meestal) goed gescheiden. Wanneer de diffusie groot is kan dit nog steeds niet genoeg zijn.
De pieken moeten namelijk niet overlappen. Om te weten hoeveel pieken je kan hebben,
gebruik je de efficiëntie. Je kunt de efficiëntie verhogen door bijv. de kolom langer maken.
Een chromatogram geeft alleen aan hoeveel eiwit erin zit. We willen absolute hoeveelheden
weten. Er zijn twee manieren om dat te berekenen:
- Externe standaardisatie. Hierbij bereken je de hoeveelheid met een soort ijklijn.
- Interne standaardisatie. Je voegt hierbij een bekende hoeveelheid van een stof x toe.
Je weet dan hoeveel er van stof x in zit en door een verhouding kun je de
hoeveelheid van de te meten stof berekenen.
Van kolomchromatografie zijn twee specifieke vormen:
- Gelfiltratie. Dit is een vorm van scheiden waarbij je
bolletjes gebruikt om de eiwitten te scheiden. In de
bolletjes zijn verschillende routes. De kleine eiwitten
kunnen door veel van die routes en blijven langer in de
kolom. De grote eiwitten passen niet door de routes en
gaan langs de bolletjes gelijk uit de kolom. Deze soort
scheiding is scheiding op basis van grootte. Het
elutievolume van de grote eiwitten is hetzelfde als de
dode tijd, omdat ze gelijk uit de kolom komen, dus Ve =
V0. Bij de kleinere eiwitten geldt Ve = V0 + Vi (=Vt). Er
zijn veel verschillende soorten gel beats (bolletjes) die allemaal andere groottes
eiwitten kunnen scheiden. Eiwitten die heel groot zijn komen allemaal op hetzelfde
moment van de kolom af, net als eiwitten die heel klein zijn. Het gebied daartussen is
een rechte lijn (ax + b) waarmee we kunnen rekenen. (houd er rekening mee dat de
log van molmassa op de y-as staat).
, - Affiniteitschromatografie. Dit is een vorm van scheiden die specifiek is bedoeld voor
eiwitten. Je kunt er geen andere moleculen mee scheiden. Een eiwit heeft een
primaire, secundaire, tertiaire en soms een quaternaire
structuur. Er bestaan eiwit-eiwit interacties; de quaternaire
structuur of een ligand die bindt aan een receptor. Een
ligand kan binden aan de receptor, dit is heel specifiek. In
de kolom kunnen receptoren zitten waaraan bepaalde
eiwitten binden. Deze binding moet je uiteindelijk weer
verbreken om het eiwit los te krijgen van de receptor (de
binding tussen eiwit en receptor is namelijk sterk). Je kunt
bijvoorbeeld de pH veranderen waardoor de eiwitten
denatureren en loskomen van de receptor. Ook kun je
zorgen dat de receptor of het eiwit zelf gaat binden aan een andere stof
(competitieve binding).
Je kunt ook het eiwit taggen (op DNA niveau). Hiervan zijn verschillende voorbeelden
(die je uit je hoofd moet kennen). Je kunt bijvoorbeeld GST (glutathion-S-transferase)
aan eiwit x plakken. Op de kolom zit glutathion waar het GST-eiwit-complex aan
bindt. Vervolgens wordt er geëlueerd met nog meer glutathion en komt dit hele
complex vrij. Er is dan een enzym die het eiwit x hier vanaf kan knippen. Een ander
voorbeeld is een His-tag (bestaande uit 6-8 histidine moleculen). Dit wordt aan het
eiwit geplakt en er wordt geëlueerd met imidazole. Antilichamen kunnen ook een rol
spelen bij het taggen van een eiwit. Protein a of g zit dat aan de kolom waaraan een
antilichaam bindt. Het antilichaam kan dan binden aan een eiwit. De elutie is hierbij
pH verlaging.
Les 2: Scheiding op basis van polariteit en elektroforese
Polariteit ontstaat als elektronen in covalente bindingen niet
netjes verdeeld zijn. Dit zorgt voor een dipoolmoment.
Adsorptiechromatografie: Hierbij is de stationaire fase vast (en
polair) en de mobiele fase is vloeibaar. Dit is scheiding op basis
van polariteit. Bij dunne laag chromatografie is de stationaire
fase een papiertje. Het papiertje moet stoffen kunnen
absorberen, het papiertje is polair. De mobiele fase is hierbij
vloeibaar en apolair. Je kunt de stoffen aankleuren om de
stoffen aan te tonen. Je kunt hierbij 2 R-waardes
berekenen:
- Rf: hoe ver je stof heeft gelopen.
- Rx: Je voegt hierbij een referentiestof toe
waarvan je de waardes weet.
Les 1: Basisbegrippen voor scheidingsmethoden, gelfiltratie en
affiniteitschromatografie
Chromatografie is een methode om stoffen van elkaar te scheiden. In deze les gaat het
specifiek om het scheiden van eiwitten. Chromatografie kan worden onderverdeeld in twee
typen; preparatief en analytisch. Bij preparatief wil je een specifiek stofje overhouden. Bij
analytisch wil je weten waaruit je mengsel bestaat.
Bij chromatografie zijn er twee ‘’onderdelen’’: de stationaire fase en de mobiele fase. De
stationaire fase is vast en de mobiele fase is vloeibaar en loopt langs de stationaire fase. De
twee fasen mengen niet met elkaar. De moleculen in de stationaire fase gaan interacties aan
met de moleculen in de mobiele fase. Als een molecuul in de mobiele fase geen bindingen
aan kan gaan met moleculen in de stationaire fase, loopt het snel van de kolom af. De
stoffen die we van elkaar willen scheiden door middel van chromatografie lopen niet met
dezelfde snelheid over de kolom.
Kolomchromatografie is een soort chromatografisch systeem. Bij kolomchromatografie is er
een probleem; de diffusie. Er gaat namelijk variatie ontstaan tussen het moment dat de
moleculen van de kolom afkomen, dit gebeurt als het scheiden langer duurt. Je wilt dus
eigenlijk zo snel mogelijk de stoffen over de kolom heen laten lopen. Om daarbij te helpen
worden vaak pompen gebruikt die ervoor zorgen dat de stoffen sneller over de kolom heen
lopen. Er zijn daarvan twee soorten systemen; HPLC en FPLC. Het verschil van deze
soorten is dat bij HPLC de druk veel hoger is, dit systeem wordt daarom vooral gebruikt bij
kleine biologische moleculen. Bij FPLC is de druk lager, dit systeem wordt daarom gebruikt
bij grotere moleculen. FPLC is dus beter voor het scheiden van eiwitten, omdat de eiwitten
niet kapot worden gemaakt.
In de meeste gevallen is de stationaire fase vast en de mobiele fase vloeibaar. Bij
gaschromatografie is de mobiele fase gasvormig, dit wordt in de life sciences niet veel
gebruikt.
In het chromatografische systeem zit tussen de kolom en de buizen een detector. Deze
stuurt signalen door naar een computer. Op de computer is dan een grafiek te zien met
pieken. UV kan aminozuren detecteren en wanneer er een piek bij UV zit, betekent het dat
er eiwitten van de kolom afkomen. Uit zo’n chromatogram kun je veel informatie halen zoals:
- De dode tijd (T0,V0). De dode tijd is hoeveel tijd (of volume) er nodig is voor de
mobiele fase om de kolom te verlaten.
- De retentietijd (Tr) is de tijd tussen het injecteren van het monster en het midden van
de piek van het eluaat. De netto retentietijd is Tr - T0. Stoffen met een langere
retentietijd binden beter aan de kolom.
- De piekhoogte vertelt iets over hoeveel van een stof in je mengsel zit.
, - De breedte van de piek (W) geeft de diffusie aan. Hoe meer verschil in tijd (meer
diffusie), hoe breder de piek. Je wilt dus een smalle piek, want dan is de scheiding
beter. De pieken moeten elkaar niet overlappen.
- De selectiviteit (α) zegt iets over hoe ver de pieken uit elkaar
liggen. Hoe groter de selectiviteit, hoe beter de scheiding.
- De resolutie (R) is het verschil tussen de pieken in verhouding tot
de breedte ervan.
- De efficiëntie is een maat voor de hoeveelheid pieken die je kan
hebben in een kolom, ook wel het schotelgetal.
Als de resolutie groter is dan 1 liggen de pieken goed van elkaar af en zijn de eiwitten
(meestal) goed gescheiden. Wanneer de diffusie groot is kan dit nog steeds niet genoeg zijn.
De pieken moeten namelijk niet overlappen. Om te weten hoeveel pieken je kan hebben,
gebruik je de efficiëntie. Je kunt de efficiëntie verhogen door bijv. de kolom langer maken.
Een chromatogram geeft alleen aan hoeveel eiwit erin zit. We willen absolute hoeveelheden
weten. Er zijn twee manieren om dat te berekenen:
- Externe standaardisatie. Hierbij bereken je de hoeveelheid met een soort ijklijn.
- Interne standaardisatie. Je voegt hierbij een bekende hoeveelheid van een stof x toe.
Je weet dan hoeveel er van stof x in zit en door een verhouding kun je de
hoeveelheid van de te meten stof berekenen.
Van kolomchromatografie zijn twee specifieke vormen:
- Gelfiltratie. Dit is een vorm van scheiden waarbij je
bolletjes gebruikt om de eiwitten te scheiden. In de
bolletjes zijn verschillende routes. De kleine eiwitten
kunnen door veel van die routes en blijven langer in de
kolom. De grote eiwitten passen niet door de routes en
gaan langs de bolletjes gelijk uit de kolom. Deze soort
scheiding is scheiding op basis van grootte. Het
elutievolume van de grote eiwitten is hetzelfde als de
dode tijd, omdat ze gelijk uit de kolom komen, dus Ve =
V0. Bij de kleinere eiwitten geldt Ve = V0 + Vi (=Vt). Er
zijn veel verschillende soorten gel beats (bolletjes) die allemaal andere groottes
eiwitten kunnen scheiden. Eiwitten die heel groot zijn komen allemaal op hetzelfde
moment van de kolom af, net als eiwitten die heel klein zijn. Het gebied daartussen is
een rechte lijn (ax + b) waarmee we kunnen rekenen. (houd er rekening mee dat de
log van molmassa op de y-as staat).
, - Affiniteitschromatografie. Dit is een vorm van scheiden die specifiek is bedoeld voor
eiwitten. Je kunt er geen andere moleculen mee scheiden. Een eiwit heeft een
primaire, secundaire, tertiaire en soms een quaternaire
structuur. Er bestaan eiwit-eiwit interacties; de quaternaire
structuur of een ligand die bindt aan een receptor. Een
ligand kan binden aan de receptor, dit is heel specifiek. In
de kolom kunnen receptoren zitten waaraan bepaalde
eiwitten binden. Deze binding moet je uiteindelijk weer
verbreken om het eiwit los te krijgen van de receptor (de
binding tussen eiwit en receptor is namelijk sterk). Je kunt
bijvoorbeeld de pH veranderen waardoor de eiwitten
denatureren en loskomen van de receptor. Ook kun je
zorgen dat de receptor of het eiwit zelf gaat binden aan een andere stof
(competitieve binding).
Je kunt ook het eiwit taggen (op DNA niveau). Hiervan zijn verschillende voorbeelden
(die je uit je hoofd moet kennen). Je kunt bijvoorbeeld GST (glutathion-S-transferase)
aan eiwit x plakken. Op de kolom zit glutathion waar het GST-eiwit-complex aan
bindt. Vervolgens wordt er geëlueerd met nog meer glutathion en komt dit hele
complex vrij. Er is dan een enzym die het eiwit x hier vanaf kan knippen. Een ander
voorbeeld is een His-tag (bestaande uit 6-8 histidine moleculen). Dit wordt aan het
eiwit geplakt en er wordt geëlueerd met imidazole. Antilichamen kunnen ook een rol
spelen bij het taggen van een eiwit. Protein a of g zit dat aan de kolom waaraan een
antilichaam bindt. Het antilichaam kan dan binden aan een eiwit. De elutie is hierbij
pH verlaging.
Les 2: Scheiding op basis van polariteit en elektroforese
Polariteit ontstaat als elektronen in covalente bindingen niet
netjes verdeeld zijn. Dit zorgt voor een dipoolmoment.
Adsorptiechromatografie: Hierbij is de stationaire fase vast (en
polair) en de mobiele fase is vloeibaar. Dit is scheiding op basis
van polariteit. Bij dunne laag chromatografie is de stationaire
fase een papiertje. Het papiertje moet stoffen kunnen
absorberen, het papiertje is polair. De mobiele fase is hierbij
vloeibaar en apolair. Je kunt de stoffen aankleuren om de
stoffen aan te tonen. Je kunt hierbij 2 R-waardes
berekenen:
- Rf: hoe ver je stof heeft gelopen.
- Rx: Je voegt hierbij een referentiestof toe
waarvan je de waardes weet.
