Samenvatting – Microscopische Beeldvorming
Hs. 1 Basics of light microscopy
Een microscoop moet 3 taken uitvoeren:
1) Vergroten: produceren van een vergroot beeld van het voorbeeld
2) Resolutie: scheiden van de details in het beeld
3) Contrast: details zichtbaar voor het oog, de camera oid. maken.
Licht varieert van radiogolven tot gammastralen. Elektromagnetische straling golven zijn fluctuaties
van elektrische en magnetische velden, die energie kunnen transporteren van een locatie naar een
andere. Het is een stroom van fotonen, die elk een golflengte eigenschap bezitten bij de
lichtsnelheid. Licht gedraagt zich als een golf.
Reflectie
Alle golven ondergaan reflectie als ze een obstakel tegenkomen. Objecten zoals spiegels, met een
oppervlakte zo glad dat alle oneffenheden kleiner zijn dan de golflengte van licht, zullen al het
invallende licht reflecteren; spiegelende reflectie. Hierbij geldt dat de hoek van inval gelijk is aan de
hoek van breking. De meeste objecten tonen diffuse reflectie; het licht wordt gereflecteerd in alle
richtingen.
Refractie
Als licht van het ene medium in een ander medium gaat, zal de lichtsnelheid afnemen. Dit leidt vaak
tot ombuiging van het licht; refractie. Refractie hangt af van het medium waar het licht doorgeen
gaat. n=c/v
Van ijl medium dicht medium: breking naar normaal toe.
Van dicht medium ijl medium: breking van normaal af
Sin hoek 1 / sin hoek 2 = n2 / n1
De brekingsindex van materialen varieert met de golflengte (en frequentie) van licht. In een prisma
valt wit licht uiteen in alle kleuren: dispersie. Dispersie veroorzaakt de brandpuntsafstand van lenzen
om golflengte afhankelijk te zijn. De brekingsindex neemt af met toenemende golflengte en neemt
toe met frequentie. De brekingsindex van blauw licht is hoger dan voor rood licht.
Diffractie
Als licht golven een barrière tegenkomen, zullen ze uitspreiden rond die barrière: diffractie. (vb
diffractie van zonlicht door wolken zichtbaar als een zilveren randje).
Als een lichtgolf zich voorplant door een spleet, is het resultaat afhankelijk van de breedte van de
spleet (apertuur) en de golflengte van het licht; Sin hoek = golflengte / d.
Diffractie limiteert het resolutie vermogen van een optisch instrument. Diffractie ontstaat uit
interferentie; verschillende delen van een golf reizen via verschillende paden naar de observator,
deze verschillende weglengtes resulteren in verschillende fasen.
Constructieve interferentie: de twee golven zijn verschoven in dezelfde richtingversterkt signaal.
Destructieve interferentie: de twee golven zijn verschoven in tegenovergestelde richting geen
signaal.
Darkfield microscopie
Blokkeren van centrale lichtstralen doorheen het staal, alleen doorlaten van schuine lichtstralen. Dit
geeft een donkere achtergrond.
Fase contrast microscopie
1
,Lichtstalen van de 0de orde gaan ongehinderd doorheen het staal. Licht wat gediffracteerd wordt
door het staal vermindert niet in amplitude, maar wordt vertraagd door het staal (brekingsindex).
In het geval het directe licht en het gediffracteerde licht een ½ golflengte verschillen, zal destructieve
interferentie optreden. Dit resulteert in donker gekleurde details op het beeld op een lichtere
achtergrond; positieve of donker fase contrast.
In het geval het directe licht en het gediffracteerde licht een ¼ golflengte verschillen, zal
constructieve interferentie optreden. Dit resulteert in helder beeld van de details van het staal op
een donkere achtergrond; negatieve of helder contrast. witte rand rond objecten.
DIC: Differential Interference Contrast
Licht van een lamp gaat door een polarisator (die zich onder de condensor bevindt). In het lichtpad
bevindt zich een gemodifieerde Wollaston prisma (eveneens onder de condensor). Deze splitst het
gepolariseerde licht in twee stralen, die een verschillende richting opgaan. Voor iedere sterkte van
het objectief is een andere prisma nodig. Het vlakke gepolariseerde licht, bewegend loodrecht op de
voortplantingsrichting van het licht, komt de Wollaston prisma binnen en wordt in 2 stralen gesplitst,
die loodrecht op elkaar bewegen. De stralen kruisen thv. de frontale kant van de condensor. Ze
bewegen parallel en loodrecht op elkaar. Ze kunnen dus nooit interferentie veroorzaken. Wanneer
de lichtstralen doorheen het specimen gaan, treden er veranderingen op in het golf pad van beide
stralen. Als de parallelle stralen het objectief bereiken, zijn ze gefocusseerd boven de rear focal
plane, waar ze een 2e Wollaston prisma binnentreden. Deze prisma combineert beide stralen. Als een
resultaat van het gaan doorheen het specimen, hebben beide lichtstralen niet een gelijke padlengte.
Er bestaat een optisch pad verschil voor de verschillende areas van het specimen. Om dit te
visualiseren, wordt een tweede polarisator geplaats (boven de bovenste Wollaston prisma). Het licht
wordt naar het oculair gestuurd, waar het geobserveerd kan worden als verschillen in intensiteit en
kleur. Dit geeft aan de ene kant een helder gedetailleerd beeld (kleur) en aan de andere kant een
donkerder beeld (of andere kleur). Zo ontstaat een pseudo 3 D weergave van het specimen.
verhoogd contrast, reliëf.
Hs. 2 Fluorescentie microscopie
Luminescentie is de emissie van licht van een bepaalde substantie, het wordt veroorzaakt door
conversies tussen elektronische geëxciteerde staten. Luminescentie wordt verdeeld in twee
categorieën: fluorescentie en fosforescentie. Fluorescentie is erg snel, terwijl fosforescentie een
traag proces is.
Fluorescentie is de emissie van licht (lagere golflengte) dat ontstaat binnen nanoseconden na de
absorptie van licht. Het verschil tussen de excitatie en emissie golflengtes is de Stokes shift. Door het
geëxciteerde licht uit te filteren zonder het geëmitteerde licht te blokkeren, kunnen objecten gezien
worden die fluorescent zijn.
Moleculen die gebruikt worden naar de waarde van hun fluorescente eigenschappen worden
fluoroforen genoemd. De meest buitenste elektronen orbitaal in de fluorofore molecule geeft zijn
efficiëntie weer als fluorescente compound en de golflengtes van absorptie en emissie.
Als fluorescente moleculen in hun grondtoestand licht energie (fotonen) absorberen, kunnen
veranderingen optreden in de elektronische, vibrationele en rotationele staten van de molecule. De
geabsorbeerde energie kan eveneens een elektron in een verder gelegen orbitaal brengen.
Emissie/fluorescentie is altijd lager in energie dan absorptie, dus heeft een hogere golflengte. De
snelheid van fosforescentie ligt tussen 10^-6 tot 1 sec.
2
, Jablonksi diagram.
Elektronische staten van organische moleculen kunnen gegroepeerd worden in twee categorieën:
singlet states (S) en triplet states (T). In een singlet state hebben alle elektronen in de molecule een
gepaarde spin. In een triplet state heeft een set elektronen ongepaarde spin. (verboden staat). Elke
elektronische staat heeft een nummer van vibrationele levels. De staten worden verticaal
gerangschikt bij energie en horizontaal bij spin multipliciteit.
Mogelijke transities tussen energiestaten:
- vibrationele relaxatie: relaxatie van de geëxciteerde staat naar zijn laagste vibrationele niveau.
- interne conversie: vibrationele staat van elektronische geëxciteerde staat kan overgaan naar een
vribrationele staat van een lagere elektronische staat (S2 S1).
- intersystem crossing: transitie naar een staat met verschillende spin multipliciteit (fosforescentie)
De tijd, nodig om een molecule van de grondtoestand naar een geëxciteerde toestand te krijgen, ligt
in de grootteorde van femtoseconden (10^-15 s).
Fluorescentie microscoop
Epi-fluorescente microscopie
Probleem: spectrale overlap
Oplossing: dichroische spiegel.
Deze wordt gebruikt in het lichtpad onder een hoek van 45 graden. Licht van een lagere golflengte
wordt gereflecteerd en licht van een hogere golflengte wordt doorgelaten.
Dichroïsche spiegels worden gewoonlijk gebruikt in combinatie met twee filters:
-de excitatie filter; die de geëxciteerde golflengte selecteert.
-de barrière (emissie) filter; die de hogere golflengte toelaat naar de detector te gaan.
Image Brightness ~ NA4/M2; hoe groter de vergroting, hoe minder licht je opvangt.
3
Hs. 1 Basics of light microscopy
Een microscoop moet 3 taken uitvoeren:
1) Vergroten: produceren van een vergroot beeld van het voorbeeld
2) Resolutie: scheiden van de details in het beeld
3) Contrast: details zichtbaar voor het oog, de camera oid. maken.
Licht varieert van radiogolven tot gammastralen. Elektromagnetische straling golven zijn fluctuaties
van elektrische en magnetische velden, die energie kunnen transporteren van een locatie naar een
andere. Het is een stroom van fotonen, die elk een golflengte eigenschap bezitten bij de
lichtsnelheid. Licht gedraagt zich als een golf.
Reflectie
Alle golven ondergaan reflectie als ze een obstakel tegenkomen. Objecten zoals spiegels, met een
oppervlakte zo glad dat alle oneffenheden kleiner zijn dan de golflengte van licht, zullen al het
invallende licht reflecteren; spiegelende reflectie. Hierbij geldt dat de hoek van inval gelijk is aan de
hoek van breking. De meeste objecten tonen diffuse reflectie; het licht wordt gereflecteerd in alle
richtingen.
Refractie
Als licht van het ene medium in een ander medium gaat, zal de lichtsnelheid afnemen. Dit leidt vaak
tot ombuiging van het licht; refractie. Refractie hangt af van het medium waar het licht doorgeen
gaat. n=c/v
Van ijl medium dicht medium: breking naar normaal toe.
Van dicht medium ijl medium: breking van normaal af
Sin hoek 1 / sin hoek 2 = n2 / n1
De brekingsindex van materialen varieert met de golflengte (en frequentie) van licht. In een prisma
valt wit licht uiteen in alle kleuren: dispersie. Dispersie veroorzaakt de brandpuntsafstand van lenzen
om golflengte afhankelijk te zijn. De brekingsindex neemt af met toenemende golflengte en neemt
toe met frequentie. De brekingsindex van blauw licht is hoger dan voor rood licht.
Diffractie
Als licht golven een barrière tegenkomen, zullen ze uitspreiden rond die barrière: diffractie. (vb
diffractie van zonlicht door wolken zichtbaar als een zilveren randje).
Als een lichtgolf zich voorplant door een spleet, is het resultaat afhankelijk van de breedte van de
spleet (apertuur) en de golflengte van het licht; Sin hoek = golflengte / d.
Diffractie limiteert het resolutie vermogen van een optisch instrument. Diffractie ontstaat uit
interferentie; verschillende delen van een golf reizen via verschillende paden naar de observator,
deze verschillende weglengtes resulteren in verschillende fasen.
Constructieve interferentie: de twee golven zijn verschoven in dezelfde richtingversterkt signaal.
Destructieve interferentie: de twee golven zijn verschoven in tegenovergestelde richting geen
signaal.
Darkfield microscopie
Blokkeren van centrale lichtstralen doorheen het staal, alleen doorlaten van schuine lichtstralen. Dit
geeft een donkere achtergrond.
Fase contrast microscopie
1
,Lichtstalen van de 0de orde gaan ongehinderd doorheen het staal. Licht wat gediffracteerd wordt
door het staal vermindert niet in amplitude, maar wordt vertraagd door het staal (brekingsindex).
In het geval het directe licht en het gediffracteerde licht een ½ golflengte verschillen, zal destructieve
interferentie optreden. Dit resulteert in donker gekleurde details op het beeld op een lichtere
achtergrond; positieve of donker fase contrast.
In het geval het directe licht en het gediffracteerde licht een ¼ golflengte verschillen, zal
constructieve interferentie optreden. Dit resulteert in helder beeld van de details van het staal op
een donkere achtergrond; negatieve of helder contrast. witte rand rond objecten.
DIC: Differential Interference Contrast
Licht van een lamp gaat door een polarisator (die zich onder de condensor bevindt). In het lichtpad
bevindt zich een gemodifieerde Wollaston prisma (eveneens onder de condensor). Deze splitst het
gepolariseerde licht in twee stralen, die een verschillende richting opgaan. Voor iedere sterkte van
het objectief is een andere prisma nodig. Het vlakke gepolariseerde licht, bewegend loodrecht op de
voortplantingsrichting van het licht, komt de Wollaston prisma binnen en wordt in 2 stralen gesplitst,
die loodrecht op elkaar bewegen. De stralen kruisen thv. de frontale kant van de condensor. Ze
bewegen parallel en loodrecht op elkaar. Ze kunnen dus nooit interferentie veroorzaken. Wanneer
de lichtstralen doorheen het specimen gaan, treden er veranderingen op in het golf pad van beide
stralen. Als de parallelle stralen het objectief bereiken, zijn ze gefocusseerd boven de rear focal
plane, waar ze een 2e Wollaston prisma binnentreden. Deze prisma combineert beide stralen. Als een
resultaat van het gaan doorheen het specimen, hebben beide lichtstralen niet een gelijke padlengte.
Er bestaat een optisch pad verschil voor de verschillende areas van het specimen. Om dit te
visualiseren, wordt een tweede polarisator geplaats (boven de bovenste Wollaston prisma). Het licht
wordt naar het oculair gestuurd, waar het geobserveerd kan worden als verschillen in intensiteit en
kleur. Dit geeft aan de ene kant een helder gedetailleerd beeld (kleur) en aan de andere kant een
donkerder beeld (of andere kleur). Zo ontstaat een pseudo 3 D weergave van het specimen.
verhoogd contrast, reliëf.
Hs. 2 Fluorescentie microscopie
Luminescentie is de emissie van licht van een bepaalde substantie, het wordt veroorzaakt door
conversies tussen elektronische geëxciteerde staten. Luminescentie wordt verdeeld in twee
categorieën: fluorescentie en fosforescentie. Fluorescentie is erg snel, terwijl fosforescentie een
traag proces is.
Fluorescentie is de emissie van licht (lagere golflengte) dat ontstaat binnen nanoseconden na de
absorptie van licht. Het verschil tussen de excitatie en emissie golflengtes is de Stokes shift. Door het
geëxciteerde licht uit te filteren zonder het geëmitteerde licht te blokkeren, kunnen objecten gezien
worden die fluorescent zijn.
Moleculen die gebruikt worden naar de waarde van hun fluorescente eigenschappen worden
fluoroforen genoemd. De meest buitenste elektronen orbitaal in de fluorofore molecule geeft zijn
efficiëntie weer als fluorescente compound en de golflengtes van absorptie en emissie.
Als fluorescente moleculen in hun grondtoestand licht energie (fotonen) absorberen, kunnen
veranderingen optreden in de elektronische, vibrationele en rotationele staten van de molecule. De
geabsorbeerde energie kan eveneens een elektron in een verder gelegen orbitaal brengen.
Emissie/fluorescentie is altijd lager in energie dan absorptie, dus heeft een hogere golflengte. De
snelheid van fosforescentie ligt tussen 10^-6 tot 1 sec.
2
, Jablonksi diagram.
Elektronische staten van organische moleculen kunnen gegroepeerd worden in twee categorieën:
singlet states (S) en triplet states (T). In een singlet state hebben alle elektronen in de molecule een
gepaarde spin. In een triplet state heeft een set elektronen ongepaarde spin. (verboden staat). Elke
elektronische staat heeft een nummer van vibrationele levels. De staten worden verticaal
gerangschikt bij energie en horizontaal bij spin multipliciteit.
Mogelijke transities tussen energiestaten:
- vibrationele relaxatie: relaxatie van de geëxciteerde staat naar zijn laagste vibrationele niveau.
- interne conversie: vibrationele staat van elektronische geëxciteerde staat kan overgaan naar een
vribrationele staat van een lagere elektronische staat (S2 S1).
- intersystem crossing: transitie naar een staat met verschillende spin multipliciteit (fosforescentie)
De tijd, nodig om een molecule van de grondtoestand naar een geëxciteerde toestand te krijgen, ligt
in de grootteorde van femtoseconden (10^-15 s).
Fluorescentie microscoop
Epi-fluorescente microscopie
Probleem: spectrale overlap
Oplossing: dichroische spiegel.
Deze wordt gebruikt in het lichtpad onder een hoek van 45 graden. Licht van een lagere golflengte
wordt gereflecteerd en licht van een hogere golflengte wordt doorgelaten.
Dichroïsche spiegels worden gewoonlijk gebruikt in combinatie met twee filters:
-de excitatie filter; die de geëxciteerde golflengte selecteert.
-de barrière (emissie) filter; die de hogere golflengte toelaat naar de detector te gaan.
Image Brightness ~ NA4/M2; hoe groter de vergroting, hoe minder licht je opvangt.
3
