WEEFSELLEER
SAMENVATTING
H1
Cel (nt)
- Vorm volgt functie
- Macroscopie
• Bestuderen met blote oog
• Anatomie
- Microscopie
• Bestuderen met microscoop
• Histologie
- Wegname van weefsels en cellen
• Operatief
o Van organen/weefsels
o 3 soorten
§ Levend
¨ = cytologie
¨ Steriel werken (!)
§ Dood
¨ Invriezen
¨ Fixeren
• Biopsie
• Afzonderlijke cellen
o Aspiratie van weefsel
o Punctievloeistof hol orgaan
o Lichaamsvochten
§ Sputum
¨ Slijm + speeksel
¨ In luchtwegen
§ Urine
§ Bloed
o Schraapsel
Anatomopathologisch onderzoek (nt)
- Belang bij wetenschappelijk onderzoek en kliniek
- Doel
• Diagnose stellen
- Kennis van
• Histologie
o Studie microscopische structuur
§ Van biologisch materiaal
§ In weefselverband
• Cytologie
o Studie van losse cellen
o Niet in weefselverband
1
,Microscopie
- Resolutie
• Kleinste afstand tussen 2 elementen
o Waarbij ze afzonderlijk zichtbaar zijn
• EM: 0,1nm
• LM: 0,2 µm
• Formule
0,61𝜆
𝑅=
𝑁𝐴
o NA
§ Numerieke apertuur
§ Hoeveel licht lens opvangt
• Lichtmicroscopie: 10-7
• Elektronenmicroscopie: 10-10
Lichtmicroscopie
- Soorten
• Wit licht
o Fotonen
o Transmissiemicroscopie
o Weerkaatsingmicroscopie
o Eigenschappen
§ Vergrotingen
¨ Oculair (20x)
¨ Lens (10x)
§ Preparaat/staal
¨ Klein/dun genoeg
¨ Weefsel kleuren
• Fluorescent licht
o Fluoroforen
o Belichten met golflengte
§ λ moet optimaal zijn
§ Fluorfoor vangt licht op (λ1) " wordt geëxciteerd " straal licht uit (λ2) " λ1<λ2
" E1>E2
o Met
§ Chemische verbinding
§ Fluorescente eiwitten
¨ Green fluor proteïne (GFP)
- Weefselbewaring
• Doel
o Voorkomen van afbraakprocessen
§ Afbraakprocessen bij
¨ Gebrek aan zuurstof
¨ Gebrek aan afvoer van afbraakproducten
¨ Vrijkomen van verteringsenzymen
• Fixeren of invriezen
o Afremmen verteringsprocessen en groei
o Behouden van macromoleculaire structuur
o Fixeren
§ Met fixatievloeistof
¨ = Fixator
¨ 5x volume van weefsel
¨ Bv. formol
§ Crosslinking
¨ Vormen covalente bindingen
¨ Met N-terminale groepen van eiwitten
¨ Vasthechten eiwitten aan cytoskelet
2
, § Verlies van enzymatische werking (vaak)
§ Duur
¨ 2-24uur
¨ Afhankelijk van grootte materiaal en methode
§ Voordelen
¨ Goede bewaring
o Invriezen
§ In N2 (l)
§ = fresh frozen
§ Moet snel gebeuren
¨ Met OCT-oplossing + onderkoeld isopentaan
§ Voor kleine weefsels
§ Afremmen enzymatische processen
¨ Bij 37°C weer functie
§ Voordelen
¨ Kan snel
¨ RNA/DNA betere kwaliteit (dan fix)
§ Nadelen
¨ Snelle afbraak van weefsel
¨ Morfologie minder mooi (dan fix)
o Daarna snijden + kleuren
§ Snijden
¨ Na fixatie te zacht
· Harder maken met paraffine
à Verloop
p Materiaal mengen met alcoholoplossing van verschillende
concentraties " alcohol verwijderen " met tolueen of xyleen
" H2O verwijderen uit materiaal " toevoeging paraffine "
opstijven " aansnijden op vriesmicrotoom
¨ Coupes
· Na aansnijden
· 5-10 µm dik
§ Kleuren
¨ Kleurstoffen
· Vaak hydrofiel
¨ Verloop
· Verwijderen paraffine " toevoeging xyleen " oplossen paraffine "
toevoeging alcohol " uitspoelen xyleen " toevoeging H2O " kleuring
¨ Haematoxyline-eosine kleuring(H&E)
· Standaard basis kleuring
· Haematoxyline
3
, à Blauw
p Eigenlijk kleurloos
p Oxidatieproduct is blauw
à Basisch
à Bindt aan zuren
à M.n. in kern
· Eosine
à Rood
à Zuur
à Bindt aan basen
à M.n. in cytoplasma en collageen
¨ Empirische kleuringen
· Ontdekt door trial and error
· Trichoomkleuring
à Mengsel van verschillende kleurstoffen
p Bv. haematoxyline
à Rood
p Keratine
p Spiervezels
à Blauw of groen
p Collageen
p Bot
à Roze of rood
p Cytoplasma
à Bruin of donkerrood
p Kernen
· Zilverkleuring
à Met zilveroplossingen
à Zichtbaar maken
p Bv. DNA en eiwitten
p Door afzetting zilverpartikels op structuur
à Visualisering van reticulline vezels (in lymfeknopen)
¨ Histochemische kleuringen
· Door chemische reactie
à Tussen weefsel en verbinding in kleuroplossing
· Bv. Periodic Acid Schiff (PAS)
à Aantonen koolhydraten
à Reagens
p Periodaat (IO4) + Schiffs reagens
p Periodaat oxideert glycol tot aldehyden
p Schiffs reagens kleurt aldehydegroepen magentarood
à Amylase
p Verteert glycogeen
r Geen kleuring
p Verteert geen glycoproteïnen
r In mucines
r Wel kleuring
¨ Enzym-histochemische kleuringen
· Enzymactiviteit
à Bepaalt kleuring
à Moet na weefselvoorbereiding bewaard zijn gebleven
· Peroxidase kleuring
à Peroxidase
p In meeste cellen + peroxisomen
à Toevoeging waterstofperoxide
p Oxideren van substraat (bv. DAB)
p Ontstaan bruine neerslag
4
SAMENVATTING
H1
Cel (nt)
- Vorm volgt functie
- Macroscopie
• Bestuderen met blote oog
• Anatomie
- Microscopie
• Bestuderen met microscoop
• Histologie
- Wegname van weefsels en cellen
• Operatief
o Van organen/weefsels
o 3 soorten
§ Levend
¨ = cytologie
¨ Steriel werken (!)
§ Dood
¨ Invriezen
¨ Fixeren
• Biopsie
• Afzonderlijke cellen
o Aspiratie van weefsel
o Punctievloeistof hol orgaan
o Lichaamsvochten
§ Sputum
¨ Slijm + speeksel
¨ In luchtwegen
§ Urine
§ Bloed
o Schraapsel
Anatomopathologisch onderzoek (nt)
- Belang bij wetenschappelijk onderzoek en kliniek
- Doel
• Diagnose stellen
- Kennis van
• Histologie
o Studie microscopische structuur
§ Van biologisch materiaal
§ In weefselverband
• Cytologie
o Studie van losse cellen
o Niet in weefselverband
1
,Microscopie
- Resolutie
• Kleinste afstand tussen 2 elementen
o Waarbij ze afzonderlijk zichtbaar zijn
• EM: 0,1nm
• LM: 0,2 µm
• Formule
0,61𝜆
𝑅=
𝑁𝐴
o NA
§ Numerieke apertuur
§ Hoeveel licht lens opvangt
• Lichtmicroscopie: 10-7
• Elektronenmicroscopie: 10-10
Lichtmicroscopie
- Soorten
• Wit licht
o Fotonen
o Transmissiemicroscopie
o Weerkaatsingmicroscopie
o Eigenschappen
§ Vergrotingen
¨ Oculair (20x)
¨ Lens (10x)
§ Preparaat/staal
¨ Klein/dun genoeg
¨ Weefsel kleuren
• Fluorescent licht
o Fluoroforen
o Belichten met golflengte
§ λ moet optimaal zijn
§ Fluorfoor vangt licht op (λ1) " wordt geëxciteerd " straal licht uit (λ2) " λ1<λ2
" E1>E2
o Met
§ Chemische verbinding
§ Fluorescente eiwitten
¨ Green fluor proteïne (GFP)
- Weefselbewaring
• Doel
o Voorkomen van afbraakprocessen
§ Afbraakprocessen bij
¨ Gebrek aan zuurstof
¨ Gebrek aan afvoer van afbraakproducten
¨ Vrijkomen van verteringsenzymen
• Fixeren of invriezen
o Afremmen verteringsprocessen en groei
o Behouden van macromoleculaire structuur
o Fixeren
§ Met fixatievloeistof
¨ = Fixator
¨ 5x volume van weefsel
¨ Bv. formol
§ Crosslinking
¨ Vormen covalente bindingen
¨ Met N-terminale groepen van eiwitten
¨ Vasthechten eiwitten aan cytoskelet
2
, § Verlies van enzymatische werking (vaak)
§ Duur
¨ 2-24uur
¨ Afhankelijk van grootte materiaal en methode
§ Voordelen
¨ Goede bewaring
o Invriezen
§ In N2 (l)
§ = fresh frozen
§ Moet snel gebeuren
¨ Met OCT-oplossing + onderkoeld isopentaan
§ Voor kleine weefsels
§ Afremmen enzymatische processen
¨ Bij 37°C weer functie
§ Voordelen
¨ Kan snel
¨ RNA/DNA betere kwaliteit (dan fix)
§ Nadelen
¨ Snelle afbraak van weefsel
¨ Morfologie minder mooi (dan fix)
o Daarna snijden + kleuren
§ Snijden
¨ Na fixatie te zacht
· Harder maken met paraffine
à Verloop
p Materiaal mengen met alcoholoplossing van verschillende
concentraties " alcohol verwijderen " met tolueen of xyleen
" H2O verwijderen uit materiaal " toevoeging paraffine "
opstijven " aansnijden op vriesmicrotoom
¨ Coupes
· Na aansnijden
· 5-10 µm dik
§ Kleuren
¨ Kleurstoffen
· Vaak hydrofiel
¨ Verloop
· Verwijderen paraffine " toevoeging xyleen " oplossen paraffine "
toevoeging alcohol " uitspoelen xyleen " toevoeging H2O " kleuring
¨ Haematoxyline-eosine kleuring(H&E)
· Standaard basis kleuring
· Haematoxyline
3
, à Blauw
p Eigenlijk kleurloos
p Oxidatieproduct is blauw
à Basisch
à Bindt aan zuren
à M.n. in kern
· Eosine
à Rood
à Zuur
à Bindt aan basen
à M.n. in cytoplasma en collageen
¨ Empirische kleuringen
· Ontdekt door trial and error
· Trichoomkleuring
à Mengsel van verschillende kleurstoffen
p Bv. haematoxyline
à Rood
p Keratine
p Spiervezels
à Blauw of groen
p Collageen
p Bot
à Roze of rood
p Cytoplasma
à Bruin of donkerrood
p Kernen
· Zilverkleuring
à Met zilveroplossingen
à Zichtbaar maken
p Bv. DNA en eiwitten
p Door afzetting zilverpartikels op structuur
à Visualisering van reticulline vezels (in lymfeknopen)
¨ Histochemische kleuringen
· Door chemische reactie
à Tussen weefsel en verbinding in kleuroplossing
· Bv. Periodic Acid Schiff (PAS)
à Aantonen koolhydraten
à Reagens
p Periodaat (IO4) + Schiffs reagens
p Periodaat oxideert glycol tot aldehyden
p Schiffs reagens kleurt aldehydegroepen magentarood
à Amylase
p Verteert glycogeen
r Geen kleuring
p Verteert geen glycoproteïnen
r In mucines
r Wel kleuring
¨ Enzym-histochemische kleuringen
· Enzymactiviteit
à Bepaalt kleuring
à Moet na weefselvoorbereiding bewaard zijn gebleven
· Peroxidase kleuring
à Peroxidase
p In meeste cellen + peroxisomen
à Toevoeging waterstofperoxide
p Oxideren van substraat (bv. DAB)
p Ontstaan bruine neerslag
4
