Moleculaire diagnostiek 2 – les 1, Human Identification (H10)
Veranderingen in genoom
- Puntmutaties (single nucleotide polymorfismes (SNP)) → silent/ missense/ nonsense
- Smale-scale mutaties → inserties/ deleties
- Large-scale mutaties → amplificaties/ chromosomale translocaties
Karyotypering: tumordiagnostiek
- Kleuren van chromosomen
- Spectral karyotypering (SKY)
- Kleurstof gebonden aan specifieke stukken DNA
- Hybridisatie
Hybridisatie (FISH, probe met label)
1. Dubbelstrengs DNA van patiënt → met target sequentie die moet worden
aangetoond
2. Denaturatie
3. Hybridisatie met gelabelde probe → tijdens renaturatie van DNA hecht de probe aan
de complementaire sequentie in het DNA
PCR
- Denaturatie → 94 °C
- Annealing → hybridisatie van primers/ Ta = Tm-5/ stringentie wordt met name door
de temperatuur bepaald
- Elongatie → 72 °C
(Reverse transcriptase: zet mRNA om in cDNA wat kan worden gebruikt voor PCR)
Analyse van PCR
1. Aantonen van PCR product → kleuring met ethidiumbromide (kwalitatief of
kwantitatief)
2. Identificeren van een PCR product → hybridisatie met een gelabelde probe
Speciale PCRs
Multiplex PCR
- Meerder primersets in 1 reactie
- Binnen 1 monster meerdere bepalingen
- Q: wie is met grote waarschijnlijkheid het slachtoffer van de verdachte
Detectietechnieken
Direct
- Absorptie bij 260 nm
- Fluorescerende kleurstoffen: bv. Ethidiumbromide en midori green
Indirect
- Hybridisatie (met probes)
- Immunologisch (met antlichamen)
Detectie van hybridisatie:
Direct:
, - Elektronenmicroscoop
Indirect via gelabelde probes
- Radio-isotopen → autoradiografie
- Fluorochromen → fluorescentiemeting
- Haptenen → specifieke antilichamen
- Enzymen → substraatomzetting (spectrofotometrie, luminescentie, gekleurd
neerslag)
Scheidingstechnieken
Elektroforese
- Southern blot (DNA)
- Northern blot (RNA)
DNA sequencing
- Sanger sequencing
DNA polymorfismes
- Grote verschillen in DNA tussen mensen → omdat 98% niet codeert voor genen
- Ong. elke 1000 tot 1500 bp is ons genoom verschillend → SNP (Single Nucleotide
Polymorfismes)
- Naast SNP ook verschillende repeterende stukken DNA waarvan iedereen een ander
aantal repetities heeft
Human Identification
Waarom?
- Forensische vraagstukken (wie is de dader)
- Klinische vraagstukken (is het monster wel van die patiënt/ donoren/ transplantaties)
- Persoonlijke vraagstukken (wie is de vader)
Vroeger: eiwitten
Tot 1988: Polymorfe eiwitten
- ABO en rhesus
- HLA (human leukocyte antigen)
- Polymorfe eiwit systemen
Uiteindelijk slechts 10 polymorfe eiwitmarkers
Nadelen:
- Onderscheidend vermogen 1 op 1000
- Biologische ‘’sporen’’ onbruikbaar
- Sperma: slechts 2 polymorfe eiwitmarkers (ABO en PGM)
Tegenwoordig → DNA
Genetische verschillen tussen mensen
- VNTRs (Variable number of Tandem Repeats)
- STRs (short tandem repeats)
- RFLPs (restriction fragment length polymorfismes)
- SNPs (single nucleotide polymorifismes)
Locus = een gen of regio in het DNA
,Allel = versie van een locus (mensen zijn diploïd, dus elke locus heeft 2 allelen)
RFLP (oud)
- (Oude) techniek om verschillen in DNA aan te tonen
- SNP’s zijn verantwoordelijk voor het introduceren of verwijderen van een restriction
site
- Door meerdere restriction sites te ‘’mappen’’ kan een DNA profiel gemaakt worden
- Gebaseerd op Southern blot
Repititief DNA
Niet coderend DNA bevat veel (40%) repetitief DNA
Minisatelliet DNA: (repeats 10-60 bp)
- VNTR’s (Variable number of tandem repeats)
- Detecteren met rescrictie enzymen en Southern blot (oud)
Microsatelliet DNA: (repeats 2-10 bp)
- STR’s (short tandem repeats)
- Op verschillende plekken in het genoom
- Gevoelig voor mutaties in aantal repeats
- Zeer geschikt voor identity assesment
- Detecteren met PCR
Voorbeeld: vaderschapstest met RFLP profiel
Father Mother
Locus Locus
1 2 1 2
Parents
Locus
1 2
Child
STR
Een betere en gevoelige methode is gebruik te maken van PCR (VNTR’s zijn daar te lang
voor)
- STR zijn kort (1-7 bp) en geschikt voor PCR (100-400 bp)
- STR’s zijn geflankeerd door unieke geconserveerde DNA sequenties, deze kunnen
gebruikt worden om unieke primers te ontwerpen
Voordelen:
- Minder DNA nodig doordat je PCR kunt toepassen
- Minimaal 10 ng ipv 100 ng DNA
- Kleinere stukken (dus gegarandeerd DNA) is geen probleem
- Veel sneller: 24-48 uur ipv 5-7 dagen
- Multiplex
, STR:
Allel ladders voor standaardisatie:
STR door capillair elektroforese:
Welke STR?
Er zijn primers voor tientallen STR’s commercieel verkrijgbaar
De naam zegt iets over de locus, of de plek op een chromosoom
- CD4: locus tussen CD4 en tirosephosphate isomerase
- D13S317: chromosoom 13, segment 317
Een extra locus (geen STR) wordt altijd meegenomen:
- Amelogenine locus: dit gen codeert voor tandmaturatie en is geloceerd op het X en Y
chromosoom. Het Y allel is 6 bp langer dan X allel. Dit resulteert in 2 pieken voor een
man en 1 voor een vrouw
CODIS: Combined DNA Indexing System
- 13 STR loci voor bepalen van DNA profiel
- In totaal zijn 22 loci (CODIS en Europese systemen) gecertificeerd
Veranderingen in genoom
- Puntmutaties (single nucleotide polymorfismes (SNP)) → silent/ missense/ nonsense
- Smale-scale mutaties → inserties/ deleties
- Large-scale mutaties → amplificaties/ chromosomale translocaties
Karyotypering: tumordiagnostiek
- Kleuren van chromosomen
- Spectral karyotypering (SKY)
- Kleurstof gebonden aan specifieke stukken DNA
- Hybridisatie
Hybridisatie (FISH, probe met label)
1. Dubbelstrengs DNA van patiënt → met target sequentie die moet worden
aangetoond
2. Denaturatie
3. Hybridisatie met gelabelde probe → tijdens renaturatie van DNA hecht de probe aan
de complementaire sequentie in het DNA
PCR
- Denaturatie → 94 °C
- Annealing → hybridisatie van primers/ Ta = Tm-5/ stringentie wordt met name door
de temperatuur bepaald
- Elongatie → 72 °C
(Reverse transcriptase: zet mRNA om in cDNA wat kan worden gebruikt voor PCR)
Analyse van PCR
1. Aantonen van PCR product → kleuring met ethidiumbromide (kwalitatief of
kwantitatief)
2. Identificeren van een PCR product → hybridisatie met een gelabelde probe
Speciale PCRs
Multiplex PCR
- Meerder primersets in 1 reactie
- Binnen 1 monster meerdere bepalingen
- Q: wie is met grote waarschijnlijkheid het slachtoffer van de verdachte
Detectietechnieken
Direct
- Absorptie bij 260 nm
- Fluorescerende kleurstoffen: bv. Ethidiumbromide en midori green
Indirect
- Hybridisatie (met probes)
- Immunologisch (met antlichamen)
Detectie van hybridisatie:
Direct:
, - Elektronenmicroscoop
Indirect via gelabelde probes
- Radio-isotopen → autoradiografie
- Fluorochromen → fluorescentiemeting
- Haptenen → specifieke antilichamen
- Enzymen → substraatomzetting (spectrofotometrie, luminescentie, gekleurd
neerslag)
Scheidingstechnieken
Elektroforese
- Southern blot (DNA)
- Northern blot (RNA)
DNA sequencing
- Sanger sequencing
DNA polymorfismes
- Grote verschillen in DNA tussen mensen → omdat 98% niet codeert voor genen
- Ong. elke 1000 tot 1500 bp is ons genoom verschillend → SNP (Single Nucleotide
Polymorfismes)
- Naast SNP ook verschillende repeterende stukken DNA waarvan iedereen een ander
aantal repetities heeft
Human Identification
Waarom?
- Forensische vraagstukken (wie is de dader)
- Klinische vraagstukken (is het monster wel van die patiënt/ donoren/ transplantaties)
- Persoonlijke vraagstukken (wie is de vader)
Vroeger: eiwitten
Tot 1988: Polymorfe eiwitten
- ABO en rhesus
- HLA (human leukocyte antigen)
- Polymorfe eiwit systemen
Uiteindelijk slechts 10 polymorfe eiwitmarkers
Nadelen:
- Onderscheidend vermogen 1 op 1000
- Biologische ‘’sporen’’ onbruikbaar
- Sperma: slechts 2 polymorfe eiwitmarkers (ABO en PGM)
Tegenwoordig → DNA
Genetische verschillen tussen mensen
- VNTRs (Variable number of Tandem Repeats)
- STRs (short tandem repeats)
- RFLPs (restriction fragment length polymorfismes)
- SNPs (single nucleotide polymorifismes)
Locus = een gen of regio in het DNA
,Allel = versie van een locus (mensen zijn diploïd, dus elke locus heeft 2 allelen)
RFLP (oud)
- (Oude) techniek om verschillen in DNA aan te tonen
- SNP’s zijn verantwoordelijk voor het introduceren of verwijderen van een restriction
site
- Door meerdere restriction sites te ‘’mappen’’ kan een DNA profiel gemaakt worden
- Gebaseerd op Southern blot
Repititief DNA
Niet coderend DNA bevat veel (40%) repetitief DNA
Minisatelliet DNA: (repeats 10-60 bp)
- VNTR’s (Variable number of tandem repeats)
- Detecteren met rescrictie enzymen en Southern blot (oud)
Microsatelliet DNA: (repeats 2-10 bp)
- STR’s (short tandem repeats)
- Op verschillende plekken in het genoom
- Gevoelig voor mutaties in aantal repeats
- Zeer geschikt voor identity assesment
- Detecteren met PCR
Voorbeeld: vaderschapstest met RFLP profiel
Father Mother
Locus Locus
1 2 1 2
Parents
Locus
1 2
Child
STR
Een betere en gevoelige methode is gebruik te maken van PCR (VNTR’s zijn daar te lang
voor)
- STR zijn kort (1-7 bp) en geschikt voor PCR (100-400 bp)
- STR’s zijn geflankeerd door unieke geconserveerde DNA sequenties, deze kunnen
gebruikt worden om unieke primers te ontwerpen
Voordelen:
- Minder DNA nodig doordat je PCR kunt toepassen
- Minimaal 10 ng ipv 100 ng DNA
- Kleinere stukken (dus gegarandeerd DNA) is geen probleem
- Veel sneller: 24-48 uur ipv 5-7 dagen
- Multiplex
, STR:
Allel ladders voor standaardisatie:
STR door capillair elektroforese:
Welke STR?
Er zijn primers voor tientallen STR’s commercieel verkrijgbaar
De naam zegt iets over de locus, of de plek op een chromosoom
- CD4: locus tussen CD4 en tirosephosphate isomerase
- D13S317: chromosoom 13, segment 317
Een extra locus (geen STR) wordt altijd meegenomen:
- Amelogenine locus: dit gen codeert voor tandmaturatie en is geloceerd op het X en Y
chromosoom. Het Y allel is 6 bp langer dan X allel. Dit resulteert in 2 pieken voor een
man en 1 voor een vrouw
CODIS: Combined DNA Indexing System
- 13 STR loci voor bepalen van DNA profiel
- In totaal zijn 22 loci (CODIS en Europese systemen) gecertificeerd
