Biotechnologie 2 lab
Lab 1: gDNA-isolatie
Principe = silica membraan technologie
Gram + zijn moeilijk te lyseren sterke complexe celwand
mechanische verstoring van celwandstructuur met behulp van beads
Elutie buffer BE: Tris-EDTA of Tris-HCl maakt DNA los van kolom
Lysis buffer MG: chaotropische zouten denaturatie eiwitten en cellysis
Wasbuffer B5: onzuiverheden verwijderen
1. Preparatie:
⁃ Bacteriesuspensie centrifugeren
⁃ SN weg
⁃ Toevoegen buffer BE
2. Lysis
⁃ Suspensie naar NucleoSpin Bead Tube Type B (kit)
⁃ Voeg Buffer MG toe
⁃ Voeg vloeibaar Proteinase K
Degradeert eiwitten die het DNA omringen en kunnen
beschadigen
Bv: nucleasen
⁃ Zet het op de swing mill en centrifugeren
3. Bindingscondities aanpassen
⁃ Nog Buffer MG toevoegen
⁃ Centrifugeren
4. Bind DNA
⁃ Breng SN over naar NucleoSpin Microbial DNA Column
⁃ Centrifugeren
5. Wassen van Silica membraan
⁃ 1ste keer met Buffer BW en centrifugeren
⁃ 2de keer met Buffer B5 en centrifugeren
6. Droog Silica membraan
⁃ Centrifugeren
7. Elueer het DNA
⁃ Plaats de Nucleospin Column in nuclease vrije buisje
⁃ Voeg Buffer BE, incubeer en centrifugeer
8. Meet absorbantie
Soorten pipetten
, Air-displacement pipet
o Luchtkolom tussen vloeistof en zuiger
Positive-displacement pipet
o Direct contact tussen vloeistof en zuiger
o Voordelen:
Voor viskeuze vloeistoffen en vloeistoffen met hoge
dampspanning
Geen luchtkolom weinig invloed externe factoren
o Nadelen:
Risico op contaminatie
Hele cap verwisselen (duurder)
Lab 2: qPCR
Maltose binding protein (MBP)
Onderdeel van het maltose/maltodextrinesysteem in E. coli (opname en
katabolisme van maltodextrines)
Soms gebruikt als fusieproteïne om oplosbaarheid en folding van andere
recombinante proteïnen te bevorderen
Expressie van recombinant MBP
Coderende sequentie van MBP gekloond in expressievector
o Ampicillineresistentie
o His-tag aan N-terminaal uiteinde van MCS
o Dubbelde lacO site voor controle van expressie m.b.v. IPTG
o Werking IPTG: induceert lac-operon omdat IPTG de lac-represoor
bindt
Nu maken de bacteriën het MBP-His-eiwit aan in grote
hoeveelheid
o Oogsten: centrifugeren, SN afpipetteren en pellet invriezen
Waarom invriezen? Cellen bewaren en inhoud (eiwitten) te
stabiliseren
Lab 1: gDNA-isolatie
Principe = silica membraan technologie
Gram + zijn moeilijk te lyseren sterke complexe celwand
mechanische verstoring van celwandstructuur met behulp van beads
Elutie buffer BE: Tris-EDTA of Tris-HCl maakt DNA los van kolom
Lysis buffer MG: chaotropische zouten denaturatie eiwitten en cellysis
Wasbuffer B5: onzuiverheden verwijderen
1. Preparatie:
⁃ Bacteriesuspensie centrifugeren
⁃ SN weg
⁃ Toevoegen buffer BE
2. Lysis
⁃ Suspensie naar NucleoSpin Bead Tube Type B (kit)
⁃ Voeg Buffer MG toe
⁃ Voeg vloeibaar Proteinase K
Degradeert eiwitten die het DNA omringen en kunnen
beschadigen
Bv: nucleasen
⁃ Zet het op de swing mill en centrifugeren
3. Bindingscondities aanpassen
⁃ Nog Buffer MG toevoegen
⁃ Centrifugeren
4. Bind DNA
⁃ Breng SN over naar NucleoSpin Microbial DNA Column
⁃ Centrifugeren
5. Wassen van Silica membraan
⁃ 1ste keer met Buffer BW en centrifugeren
⁃ 2de keer met Buffer B5 en centrifugeren
6. Droog Silica membraan
⁃ Centrifugeren
7. Elueer het DNA
⁃ Plaats de Nucleospin Column in nuclease vrije buisje
⁃ Voeg Buffer BE, incubeer en centrifugeer
8. Meet absorbantie
Soorten pipetten
, Air-displacement pipet
o Luchtkolom tussen vloeistof en zuiger
Positive-displacement pipet
o Direct contact tussen vloeistof en zuiger
o Voordelen:
Voor viskeuze vloeistoffen en vloeistoffen met hoge
dampspanning
Geen luchtkolom weinig invloed externe factoren
o Nadelen:
Risico op contaminatie
Hele cap verwisselen (duurder)
Lab 2: qPCR
Maltose binding protein (MBP)
Onderdeel van het maltose/maltodextrinesysteem in E. coli (opname en
katabolisme van maltodextrines)
Soms gebruikt als fusieproteïne om oplosbaarheid en folding van andere
recombinante proteïnen te bevorderen
Expressie van recombinant MBP
Coderende sequentie van MBP gekloond in expressievector
o Ampicillineresistentie
o His-tag aan N-terminaal uiteinde van MCS
o Dubbelde lacO site voor controle van expressie m.b.v. IPTG
o Werking IPTG: induceert lac-operon omdat IPTG de lac-represoor
bindt
Nu maken de bacteriën het MBP-His-eiwit aan in grote
hoeveelheid
o Oogsten: centrifugeren, SN afpipetteren en pellet invriezen
Waarom invriezen? Cellen bewaren en inhoud (eiwitten) te
stabiliseren
