Samenvatting cytologie cel 2

CEL II: CYTOLOGIE

HOOFDSTUK 1: PREPAREREN EN OBSERVEREN VAN CELLEN EN
WEEFSELS

CELLEN

A. INTRODUCTIE: CONDITIES VAN CELCULTUUR
Monolagen  stabiele cellijnen (afkomstig van tumorcellen, blijven groeien)

STADIA VAN CELCULTIVERING:
1. Weefsel (vb stuk tumor) enzymatisch behandelen
2. Cellen zakken uit of worden naar bodem gecentrifugeerd
3. Cellen zullen worden uigeplaat in groeirecipient (petridish) (primaire
cultuur)
4. Hopelijk overleven cellen deze behandeling en zijn ze in staat uit te
groeien
5. Indien confluente laag van cellen, cellen losmaken en splitsen (secundaire
cultuur)

TYPISCHE CELSTRUCTUREN:
 Monolaagcultuur:
 Kolonie: ontstaat uit 1 cel en bestaat uit meerdere cellen

CULTUURCONDITIES: MEM = minimum essential medium: bevat verschillende
stoffen, atmosfeer van 5% CO2  goede pH = 7,4  cellen kunnen groeien

CULTUURRECIPIËNT: aangepast voor hoeveelheid cellen; vb. gesloten flessen,
open platen, rollerflessen, CO2-oven

OORSPRONG VAN CELLEN, CELLIJNEN: Andere laboratoria, eigen isolatie
(primaire culturen), celbanken (cellen invriezen)

B. GROEISUBSTRATEN EN -PROCEDURES
 Substraat beschermt tegen anoïkis (= geprogrameerde celdoord/apoptose)
en is essentieel voor adherente culturen, ook fysische drager
 In vivo condities nabootsen in vitro
 Interactie:
o Aspecifieke fysische interactie: cellulaire adhesie en celspreiding
toelaten
o Specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en ECM 
differentiatie-inductie door stimulatie vanwege basale lamina (=
basaal membraan)
 Celdensiteits-afhankelijke inhibitie: cellen in cultuur delen tot ze confluente
2D monolaag vormen dan contactinhibitie van celproliferatie o.a. omwille
van concurentie voor mitogenen  delen + groeien (proliferatie) 
confluente monolaag (geen celproliferatie meer) nieuw medium
toevoegen  cellen groeien
Cellen splitsen om cultuur te behouden
 Tumorcellen: geen contactinhibitie  cellen groeien in hoopje/groepje

,  Celtransfer van suspensieculutrne en adherente cellen
 Stappen bij celadhesie en -spreiding: cellen zakken uit  maken contact
met substraat  progressieve spreiding over substraat  sterke binding
met substraat
 cellen kunnen migreren over celoppervlakte
 Differentiatie in cultuur

C. KWALITEITSCONTROLE
 Contaminatie met micro-organismen (mycoplasma)
 Contaminatie met vreemde cellen



 Karyotypering: zuiverheid, homogeniteit, stabiliteit van celcultuur meten
(lage passage beter)
 Inherente genetische instabiliteit

STAMCELLEN
= Celdeling/verdubbeling en differentiatie

 Totipotent: embryo
Pluripotente
 Pluripotent: ICM, blastocyst: alles behalve embryo
stamcellen van
 Multipotent: bloedcellen blastula of uit biopt
Ethiek humane embryonale stamcellen?

 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (etisch minder beladen): biopt/urine van
patiënt nemen  cellen behandelen  trg pluripotente stamcellen maken met
eiwit

WEEFSELS

 Doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
 Probleem: weinig licht (elektronen) doorlatend, weinig contrast in
biologisch materiaal
 Methode: fixeren, inbedden, snijden, kleuren of contrasteren

Secties gebruiken om subcellulaire details waar te nemen  procedure paraffine
coupes: immersifixatie  dehydratatie  vloeibare paraffine  secties snijden
met microtoom  secties op microscoop glaasje kleuren

1. Fixeren: bewaren weefsel zoals oorspronkelijke structuur = denatureren
eiwit door chemische fixatiemiddelen of invriezen weefsel
 Artefacten = veranderingen die tijdens fixatie in een weefsel
ontstaan en afwijken van de in vivo situatie

2. Inbedden: gefixeerde materiaal ontwikkelen en doordringen met
inbedmiddel (paraffine, hars,plastics) (substantie wordt hard  materiaal
snijdbaar)
 weefsel binnnendringen: water verwijderen met alcohol erna clearing
met tolueen

3. Snijden: in dunne coupes met microtoom
 LM: parrafine: met stalen mes op draagglaasje
o Resolutie 200 nm, celculturen op dekglaasje, dikker materiaal

,  Preparaat gefixeerd en gekleurd  detectie op basis
van lichtabsorptie  klassieke licht- /
klaarveldmicroscoop
 Preparaat levend met weinig contrast, ongekleurd
speciale microscopische technieken voor levende
cellen
 !Fasecontrastmicroscopie!: faseverschuiving van
licht
 Differentieel interferentie-contrastmicroscopie
 Digitale microscopie
 Fluorescentiemicroscopen!
 EM: hars, plastics met glazen/diamanten mes op grids (= metalen
roosterje)

4. Kleuren:
 Hematoxyline en eosine (H/E)
o Eosine (+): cytoplasma(eiwitten) en ECM (roos)
o Hematoxyline (-): kernen (nucleïnezuur) (blauw, paars)
 Metachromasie: koolhydraten kleurbaar met cationische kleurstoffen
(kraakbeen, mastcellen)
 Indifferente kleursroffen: vetten
 Immunohistochemische kleuring: specifieke bestanddelen door
antigen + antilichaam
 Enzymkleuring: activiteit enzym
 (Epi)fluorescentiemicroscopie: fluorochromen (= fluorescente
eiwitten)
o Ion-gevoelige kleurstoffen
o Immunofluorescentie microscopie
o Tagging



LICHTMICROSCOPIE (LM)
Resolutie 200 nm, celculturen op dekglaasje, dikker materiaal

 Preparaat gefixeerd en gekleurd  detectie op basis van lichtabsorptie 
klassieke licht- / klaarveldmicroscoop
 Preparaat levend met weinig contrast, ongekleurd speciale
microscopische technieken voor levende cellen
o !Fasecontrastmicroscopie!: faseverschuiving van licht
o Differentieel interferentie-contrastmicroscopie
o Digitale microscopie
o Fluorescentiemicroscopen!
 Conventionele (op alle dieptes) vs confocale (op 1 laag 
meer details) fluorescentiemicroscoop
o Confocaal laser scanning microscoop
 Gebruik softwares: vb deconvolutie-fluorescentiemicroscopie
 Technieken combineren (vb. DIC)
 4D live cell imaging: time lapse (richting, diepte, bij verschillende
golflengtes, over tijd)
 Flowcytometrie: deeltjes in stromende vloeistof tellen en bestuderen
gebaseerd op lichtverstrooiing en fluorescentie

PRINCIPE CONFOCAAL LASER SCANNING MICROSCOOP (CLSM)

, ELEKTRONENMICROSCOPIE (EM)
Betere resolutie, elektronenbundel

 TEM: transmissie elektronen microscopie: doorlatend, vnl binnenkantt
objecten (weefsels, cellen virussen) bestuderen
o Negatieve kleuring met verbindingen van zware metalen vb osmium
 weerkaatsen elektronen, shadow casting
o Snijden met ultramicrotoom  ultradunne secties
o Beeldvorming: densere structuren absorberen elektronen, minder
dense structuren laten elektronen door  contrast
 verhogen densitetitsverschillen = contrasteren met zware
metalen
o Detectie van specifieke eiwitten met behulp van TEM
 SEM: scanning elektronen microscopie: oppervlakte van weefsels,
macromoleculaire aggregaten of materialen in beeld brengen
 Speciale EM technieken:
o Vries-breek (2 lagen af elkaar krijgen, zeer koud + duwen met
scherp mes tegen membraan)
o Vries-ets (sublimatie = verdamping ijs in vacuüm
o Cryo-elektronen-tomografie (vanuit verschillende hoeken kijken 
beter 3D beeld
o SBF-SEM en FIB-SEM (analyse van grotere volumes)