FUNDAMENTEEL EN TOEGEPAST
BIOMEDISCH EIWITONDERZOEK
HOOFDSTUK 1: PROTEIN CHEMISTRY IN CONTEMPORARY BIOMEDICAL RESEARCH
1.1. PROTEINS, TRANSCRIPTS EN GENES
Alle informatie die nodig is om een eiwit op te bouwen is te vinden in het genoom
=> waarom eiwitten bestuderen om biochemische processen in ziekte en gezondheid te begrijpen?
Proteoform = eiwitvorm (meerdere per gen => chemische heterogeniteit in eiwitten)
- Proteoform => alle aspecten die leiden tot chemisch
verschillende eiwitmoleculen afkomstig van hetzelfde
coderende gen
- Genen kunnen meerdere transcripten hebben door:
o Verschillende modificaties
o Alternative splicing
o Coding single-nucleotide polymorphisms
o Herkenning van foute AUG-codon (upstream =
langer eiwit, downstream = korter eiwit)
- Aantal proteoforms = product van aantal mogelijke
modificaties van een AZaantal keer dit AZ in sequentie
Figuur: canonical sequence = meest voorkomende eiwitsequentie, endogenous prteolusis = stuk,e afgeknipt in bv
mitochondrie, RNA splicing = alternatieve splicing
UniProt = databank waarin alle informatie over eiwitten met 2 knowledgebases:
- Swissprot: manueel geannoteerde info (correcter)
- TrEMBL: automatische toewijzing van karakteristieken van een eiwit (niet nagekeken)
1 AZ = gemiddeld 110 Da (1 eiwitdomein = gemiddeld 100 AZ = ongeveer 11.000 Da)
Complexiteit proteoom:
- Proteoom = de volledige verzameling van alle eiwitten die op een bepaald moment door een cel, weefsel of
organisme worden geproduceerd en gemodificeerd
o Coding genes
o Non-coding genes
o Small non-coding genes
o Long non-coding genes
o Miscellaneous non-coding genes
o Pseudogenes (lijkt op een gen maar geen start- en/of stopsite)
o Gene transcripts
ð Ongeveer 20.000 genen, maar miljoenen eiwitten (inclusief proteoforms)
- Proteomics = bestuderen van het proteoom
- Eiwitten complexer dan genen en transcripten
o Meer bouwstenen (4 nucleotiden vs 20 aminozuren)
o Meerdere proteoforms per eiwit
- Individuele eiwitfamilies komen in gigantisch verschillende concentraties voor
, o Meest abundant in HeLa = histonen, actine, ribosomen
Groot bereik = uitdaging:
o Eiwitchemie heeft niet iets zoals PCR bij DNA om snel en betrouwbaar ketens te amplificeren tot
voldoende concentratie voor detectie
o Massaspectrometrie kan enkel hoge concentraties van eiwitten herkennen
o Lage concentraties te identificeren met affiniteitschromatografie met AL die grote eiwitten (zoals
albumine) uit de oplossing halen
Centraal dogma te simplistisch! (Lineaire stroom van DNA tot RNA tot eiwit)
- Modificatie van eiwitten niet in rekening gehouden => verandert eiwitfunctie
- Niet elk gen altijd actief, dus niet elk gen continu afgeschreven door histonmodificaties => niveaus van actieve
eiwitten veranderen na cellulaire stimuli
- Moleculaire componenten reguleren en begeleiden de informatiestroom:
o MicroRNA (miRNA): binden op mRNA en belemmeren de translatie ervan + destabiliseren mRNA in het
cytosol waardoor het afgebroken wordt
o Chaperones: helpen bij correcte opvouwing van eiwitten
o Eiwitcomplexen onder invloed van liganden
o Eiwitten moeten specifiek gemodificeerd worden door enzymen, moleculen of radicalen voor ze hun
functie kunnen uitoefenen (cotranslationeel)
Relatie tussen genen, transcripten en eiwitten
- Duplicatie van bepaalde genen (groen) leidt tot ook een vermeerdering
in het aantal transcripten (rood)
- Logisch: aantal eiwitten zou ook veel hoger zijn als er meer genen zijn
die ze afschrijven, maar is niet zo!
=> activiteitscontrole van transcriptie
Proteasoom = belangrijke componenten die eiwitten die fout opgevouwen
zijn of gwn weg moeten markeren en naar recylage-fabriek moeten
(‘recyclagefabriek’ = proteasoom)
=> gebruikt bij ubiquitinatie
- Niet voor elk gen een eiwitniveau aanwezig: gen niet tot expressie of
concentratie eiwit te laag voor MS
- Hier borstkankercellijn bekeken:
o Geamplificeerde genen
o Geen duidelijk verband tussen gen-, transcript- en eiwitaantallen:
fysiologische processen begrijpen = eiwitniveaus bestuderen en
verandering ervan bekijken in pathologische toestanden
,Analyse van informatie uit figuur:
- Akt1 = oncogen coderend gen (dubbel aanwezig) dat zorgt voor celgroei en overleving
o Inhiberen Akt1 expressie = inhiberen van celgroei en overleving in tumorcel
o Akt1 toont verhoogde expressie in borskankercellen
o Idem voor Nudix14 en MTA1
- AHNAK2 = draagt bij in progressie van kanker
o Amplificatie van het gen (verhoogde expressie) leidt tot vermindering van het eiwit in borsttumorcel
Butterfly effect in kanker:
- Kleine, gelokaliseerde veranderingen zoals puntmutaties kunnen een downstream cascade starten dat de
volledige cel kan modificeren en kan bijdragen aan de ontwikkeling van kanker
=> kleine verandering grote invloed op transcripten (upregulatie/ downregulatie)
Voorbeeld: vergelijking van cellijn borstepitheliale lijn MCF-ff0A en gemuteerde nakomeling
o Verschil = één enkele aminozuursubstitutie
o His à Arg => Arg hydrofoob en meer bulky
Proteoom en transcriptoom = dynamisch
- Veranderingen van eiwitniveaus na verandering in eiwitsynthese, eiwitafbraak, PTMs, eiwitrijping, eiwitsecretie,
vorming supramoleculaire complexen, …
- Eiwitaspecten niet voorspelbaar uit genoom/ transcriptoominformatie
Waarom proteomen bestuderen?
- Small proteins:
o Algoritmen voor genen te vinden vermijden voorspelling korte genen, want zou aantal valspositieven sterk
verhogen
o Veel niet-coderende RNAs (lncRNA) zorgen voor miniproteïnen (weinig gekend in databanken, maar
geidentificeerd met MS)
- Initiatie translatie:
o N-terminale AZ-sequentie bestuderen om exact startcodon te vinden in mRNA
o Translatie kan ook starten bij niet-canonieke AUG-plaatsen (vb. CUG) = neo-startcodons (75% van de
keren AUG, 25% neo-startcodon)
§ Ontdekt door ribosome profiling
o Identificatie van transcripten van niet-canonieke AUG-plaatsen moeilijk
- Voorspelling signaalpeptiden:
o Signaalpeptiden (hydrofoob) = sequentie aan N-terminus die als ‘adreskaartje’ dient dat terecht komt in
mitochondriën als mitochondriaal eiwit na klieving
o Klievingssite experimenteel te bepalen door sequentiebepaling van N-terminus of isolatie/karakterisering
van buitenste N-terminale peptide na proteolyse
- Voorspelling leesraam en stopcodon:
o EST = expressed sequence tag = onderdeel RNA-molecule = vaak niet duidelijk of ze coderende gebieden
bevatten, maar als we coderend: leesraam bepalen
o Stopcodon vinden door C-terminus van het eiwit te sequeneren
- Lokalisatie eiwitten:
o Voorspellingsprogramma: translocatiesignalen voorspellen
o Voorspellen in welk subcellulair compartiment eiwitten zich zullen bevinden of waar ze uitgescheiden
zullen worden (vb. nucleaire proteinen seq zodat ze in nucleus blijven)
, o Programma’s niet nauwkeurig: monitoring eiwit nodig voor verificatie
- Monitoring PTM’s (posttranslationele modificaties):
o Veel PTM’s continu/tijdelijk aanwezig op eiwitten => rol in moduleren structuur/functie
o Voorspellingsprogramma’s voor PTM’s onbetrouwbaar => experimenteel PTM’s zoeken met behulp van
gegevens op basis van eiwitten en hun 3D-structuur
Voorbeeld: -N-X-S/T/C- met X ≠P
o N = asparagine, X = willekeurig AZ niet proline, S/T/C = serine, threonine of cysteine
o Typisch N-glycolisatie op Asp (algoritme), maar niet altijd juist, want sterk afhankelijk van de 3D-
structuur van het eiwit (oppervlakte moet toegankelijk zijn)
- Eiwitcomplexen:
o Veel supramoleculaire complexen van eiwitten die interageren met elkaar
o Individuele componenten kunnen soms niet afzonderlijk functioneren
o Soms tijdelijke eiwitcomplexen onder omstandigheden (vb. PTM’s) om een cascade van
signaaltransductie te starten wat vaak leidt tot activering van transcriptiefactoren en expressie van
specifieke genen
o Één eiwit op verschillende manieren aanwezig => in verschillende complexen
1.2. EIWITTEN IN HET GEBIED VAN BIOMEDISCHE WETENSCHAPPEN
- Gebruik recombinante eiwitten als medicijn
o Vb. synthetische menselijke insuline recombinant aanmaken in E. Coli voor mensen met diabetes (moet
goed gezuiverd zijn om geen LPS van bacteriën mee te nemen die pathologie kunnen veroorzaken)
o Vb. CKD (nierziekte) synthetisch EPO toedienen omdat nieren dit niet genoeg aanmaken bij te staan en
bloedarmoede te verhelpen (stimulatie aanmaak RBC in beenmerg)
- Gebruik peptiden en eiwitten als vaccin
o Recombinante productie of zuivering uit pathogene organisme zelf
o Immuunreacties vaak gericht op specifieke gebieden aan oppervlakte van pathogeenspecifieke eiwitten
=> dit gebruiken om een vaccin te maken
o Eiwitvaccins injecteren = immuunrespons versterken = actieve infectie vermijden
o Vb. cholera: recombinant choleratoxine B (chemisch geïnactiveerd) toedienen
- Biologicals
o Biological = geneesmiddel met werkzame stoffen die afgeleid zijn van een biologische bron (elke stof in
laboratorium aangemaakt van een levend organisme)
=> zo ook bv synthetisch EPO of insuline
o Vb. BOTOX = neurotoxisch eiwit geïsoleerd uit Clostridium botulinium A
o Vb. nanobodies = antilichamen met één domein om menselijke ziekten te bestrijden
Geneesmiddelen: essentieel = keuze/identificatie van eiwitten waarop gericht moet worden
- Massaspectrometrie: eiwitten identificeren aanwezig in oppervlak van kankercellen
=> proteoforms laten analyseren door bedrijven en geneesmiddelen ontwikkelen hiertegen
Eiwitengineering:
Voorbeeld: subtiligase
- Subtiligase = variant serine protease subtilisine
o Bacterieel protease dat peptidebonds hydrolyseert
o Genetisch aangemaakt waarbij katalytisch serine à Cys en Pro à Ala
BIOMEDISCH EIWITONDERZOEK
HOOFDSTUK 1: PROTEIN CHEMISTRY IN CONTEMPORARY BIOMEDICAL RESEARCH
1.1. PROTEINS, TRANSCRIPTS EN GENES
Alle informatie die nodig is om een eiwit op te bouwen is te vinden in het genoom
=> waarom eiwitten bestuderen om biochemische processen in ziekte en gezondheid te begrijpen?
Proteoform = eiwitvorm (meerdere per gen => chemische heterogeniteit in eiwitten)
- Proteoform => alle aspecten die leiden tot chemisch
verschillende eiwitmoleculen afkomstig van hetzelfde
coderende gen
- Genen kunnen meerdere transcripten hebben door:
o Verschillende modificaties
o Alternative splicing
o Coding single-nucleotide polymorphisms
o Herkenning van foute AUG-codon (upstream =
langer eiwit, downstream = korter eiwit)
- Aantal proteoforms = product van aantal mogelijke
modificaties van een AZaantal keer dit AZ in sequentie
Figuur: canonical sequence = meest voorkomende eiwitsequentie, endogenous prteolusis = stuk,e afgeknipt in bv
mitochondrie, RNA splicing = alternatieve splicing
UniProt = databank waarin alle informatie over eiwitten met 2 knowledgebases:
- Swissprot: manueel geannoteerde info (correcter)
- TrEMBL: automatische toewijzing van karakteristieken van een eiwit (niet nagekeken)
1 AZ = gemiddeld 110 Da (1 eiwitdomein = gemiddeld 100 AZ = ongeveer 11.000 Da)
Complexiteit proteoom:
- Proteoom = de volledige verzameling van alle eiwitten die op een bepaald moment door een cel, weefsel of
organisme worden geproduceerd en gemodificeerd
o Coding genes
o Non-coding genes
o Small non-coding genes
o Long non-coding genes
o Miscellaneous non-coding genes
o Pseudogenes (lijkt op een gen maar geen start- en/of stopsite)
o Gene transcripts
ð Ongeveer 20.000 genen, maar miljoenen eiwitten (inclusief proteoforms)
- Proteomics = bestuderen van het proteoom
- Eiwitten complexer dan genen en transcripten
o Meer bouwstenen (4 nucleotiden vs 20 aminozuren)
o Meerdere proteoforms per eiwit
- Individuele eiwitfamilies komen in gigantisch verschillende concentraties voor
, o Meest abundant in HeLa = histonen, actine, ribosomen
Groot bereik = uitdaging:
o Eiwitchemie heeft niet iets zoals PCR bij DNA om snel en betrouwbaar ketens te amplificeren tot
voldoende concentratie voor detectie
o Massaspectrometrie kan enkel hoge concentraties van eiwitten herkennen
o Lage concentraties te identificeren met affiniteitschromatografie met AL die grote eiwitten (zoals
albumine) uit de oplossing halen
Centraal dogma te simplistisch! (Lineaire stroom van DNA tot RNA tot eiwit)
- Modificatie van eiwitten niet in rekening gehouden => verandert eiwitfunctie
- Niet elk gen altijd actief, dus niet elk gen continu afgeschreven door histonmodificaties => niveaus van actieve
eiwitten veranderen na cellulaire stimuli
- Moleculaire componenten reguleren en begeleiden de informatiestroom:
o MicroRNA (miRNA): binden op mRNA en belemmeren de translatie ervan + destabiliseren mRNA in het
cytosol waardoor het afgebroken wordt
o Chaperones: helpen bij correcte opvouwing van eiwitten
o Eiwitcomplexen onder invloed van liganden
o Eiwitten moeten specifiek gemodificeerd worden door enzymen, moleculen of radicalen voor ze hun
functie kunnen uitoefenen (cotranslationeel)
Relatie tussen genen, transcripten en eiwitten
- Duplicatie van bepaalde genen (groen) leidt tot ook een vermeerdering
in het aantal transcripten (rood)
- Logisch: aantal eiwitten zou ook veel hoger zijn als er meer genen zijn
die ze afschrijven, maar is niet zo!
=> activiteitscontrole van transcriptie
Proteasoom = belangrijke componenten die eiwitten die fout opgevouwen
zijn of gwn weg moeten markeren en naar recylage-fabriek moeten
(‘recyclagefabriek’ = proteasoom)
=> gebruikt bij ubiquitinatie
- Niet voor elk gen een eiwitniveau aanwezig: gen niet tot expressie of
concentratie eiwit te laag voor MS
- Hier borstkankercellijn bekeken:
o Geamplificeerde genen
o Geen duidelijk verband tussen gen-, transcript- en eiwitaantallen:
fysiologische processen begrijpen = eiwitniveaus bestuderen en
verandering ervan bekijken in pathologische toestanden
,Analyse van informatie uit figuur:
- Akt1 = oncogen coderend gen (dubbel aanwezig) dat zorgt voor celgroei en overleving
o Inhiberen Akt1 expressie = inhiberen van celgroei en overleving in tumorcel
o Akt1 toont verhoogde expressie in borskankercellen
o Idem voor Nudix14 en MTA1
- AHNAK2 = draagt bij in progressie van kanker
o Amplificatie van het gen (verhoogde expressie) leidt tot vermindering van het eiwit in borsttumorcel
Butterfly effect in kanker:
- Kleine, gelokaliseerde veranderingen zoals puntmutaties kunnen een downstream cascade starten dat de
volledige cel kan modificeren en kan bijdragen aan de ontwikkeling van kanker
=> kleine verandering grote invloed op transcripten (upregulatie/ downregulatie)
Voorbeeld: vergelijking van cellijn borstepitheliale lijn MCF-ff0A en gemuteerde nakomeling
o Verschil = één enkele aminozuursubstitutie
o His à Arg => Arg hydrofoob en meer bulky
Proteoom en transcriptoom = dynamisch
- Veranderingen van eiwitniveaus na verandering in eiwitsynthese, eiwitafbraak, PTMs, eiwitrijping, eiwitsecretie,
vorming supramoleculaire complexen, …
- Eiwitaspecten niet voorspelbaar uit genoom/ transcriptoominformatie
Waarom proteomen bestuderen?
- Small proteins:
o Algoritmen voor genen te vinden vermijden voorspelling korte genen, want zou aantal valspositieven sterk
verhogen
o Veel niet-coderende RNAs (lncRNA) zorgen voor miniproteïnen (weinig gekend in databanken, maar
geidentificeerd met MS)
- Initiatie translatie:
o N-terminale AZ-sequentie bestuderen om exact startcodon te vinden in mRNA
o Translatie kan ook starten bij niet-canonieke AUG-plaatsen (vb. CUG) = neo-startcodons (75% van de
keren AUG, 25% neo-startcodon)
§ Ontdekt door ribosome profiling
o Identificatie van transcripten van niet-canonieke AUG-plaatsen moeilijk
- Voorspelling signaalpeptiden:
o Signaalpeptiden (hydrofoob) = sequentie aan N-terminus die als ‘adreskaartje’ dient dat terecht komt in
mitochondriën als mitochondriaal eiwit na klieving
o Klievingssite experimenteel te bepalen door sequentiebepaling van N-terminus of isolatie/karakterisering
van buitenste N-terminale peptide na proteolyse
- Voorspelling leesraam en stopcodon:
o EST = expressed sequence tag = onderdeel RNA-molecule = vaak niet duidelijk of ze coderende gebieden
bevatten, maar als we coderend: leesraam bepalen
o Stopcodon vinden door C-terminus van het eiwit te sequeneren
- Lokalisatie eiwitten:
o Voorspellingsprogramma: translocatiesignalen voorspellen
o Voorspellen in welk subcellulair compartiment eiwitten zich zullen bevinden of waar ze uitgescheiden
zullen worden (vb. nucleaire proteinen seq zodat ze in nucleus blijven)
, o Programma’s niet nauwkeurig: monitoring eiwit nodig voor verificatie
- Monitoring PTM’s (posttranslationele modificaties):
o Veel PTM’s continu/tijdelijk aanwezig op eiwitten => rol in moduleren structuur/functie
o Voorspellingsprogramma’s voor PTM’s onbetrouwbaar => experimenteel PTM’s zoeken met behulp van
gegevens op basis van eiwitten en hun 3D-structuur
Voorbeeld: -N-X-S/T/C- met X ≠P
o N = asparagine, X = willekeurig AZ niet proline, S/T/C = serine, threonine of cysteine
o Typisch N-glycolisatie op Asp (algoritme), maar niet altijd juist, want sterk afhankelijk van de 3D-
structuur van het eiwit (oppervlakte moet toegankelijk zijn)
- Eiwitcomplexen:
o Veel supramoleculaire complexen van eiwitten die interageren met elkaar
o Individuele componenten kunnen soms niet afzonderlijk functioneren
o Soms tijdelijke eiwitcomplexen onder omstandigheden (vb. PTM’s) om een cascade van
signaaltransductie te starten wat vaak leidt tot activering van transcriptiefactoren en expressie van
specifieke genen
o Één eiwit op verschillende manieren aanwezig => in verschillende complexen
1.2. EIWITTEN IN HET GEBIED VAN BIOMEDISCHE WETENSCHAPPEN
- Gebruik recombinante eiwitten als medicijn
o Vb. synthetische menselijke insuline recombinant aanmaken in E. Coli voor mensen met diabetes (moet
goed gezuiverd zijn om geen LPS van bacteriën mee te nemen die pathologie kunnen veroorzaken)
o Vb. CKD (nierziekte) synthetisch EPO toedienen omdat nieren dit niet genoeg aanmaken bij te staan en
bloedarmoede te verhelpen (stimulatie aanmaak RBC in beenmerg)
- Gebruik peptiden en eiwitten als vaccin
o Recombinante productie of zuivering uit pathogene organisme zelf
o Immuunreacties vaak gericht op specifieke gebieden aan oppervlakte van pathogeenspecifieke eiwitten
=> dit gebruiken om een vaccin te maken
o Eiwitvaccins injecteren = immuunrespons versterken = actieve infectie vermijden
o Vb. cholera: recombinant choleratoxine B (chemisch geïnactiveerd) toedienen
- Biologicals
o Biological = geneesmiddel met werkzame stoffen die afgeleid zijn van een biologische bron (elke stof in
laboratorium aangemaakt van een levend organisme)
=> zo ook bv synthetisch EPO of insuline
o Vb. BOTOX = neurotoxisch eiwit geïsoleerd uit Clostridium botulinium A
o Vb. nanobodies = antilichamen met één domein om menselijke ziekten te bestrijden
Geneesmiddelen: essentieel = keuze/identificatie van eiwitten waarop gericht moet worden
- Massaspectrometrie: eiwitten identificeren aanwezig in oppervlak van kankercellen
=> proteoforms laten analyseren door bedrijven en geneesmiddelen ontwikkelen hiertegen
Eiwitengineering:
Voorbeeld: subtiligase
- Subtiligase = variant serine protease subtilisine
o Bacterieel protease dat peptidebonds hydrolyseert
o Genetisch aangemaakt waarbij katalytisch serine à Cys en Pro à Ala
