Samenvatting Methoden 3 ( Januari)
Hoofdstuk 2: Analyse van DNA en Genomics
1. DNA Sequentiebepaling
First generation sequencing: Sanger
- Kloneren, elektroforese (scheiding van fragmenten op grootte)
- Veel gebruikt voor kleine projecten
Second generation sequencing: NGS (Next Generation Sequencing)
- Gebaseerd op short read (30-100 bp)
- Met alle sequencen puzzelen we een volledig humaan genoom
- Illumina, ion Torrent
Third Generation sequencing: Next-next generation Sequencing
- Kijken naar hele lang fragmenten van DNA (duizenden, miljoenen bp)
- Belangrijk bij een repetitieve sequentie om daardoor te lezen
- Individuele moleculen gaan sequencing
- Geen amplificatie
- Nanopore, PacBio
Brede toepassingen
1. Novo Genoom Sequentie bepaling: ongekende genomen worden gesequenced
2. Requencing: individuen vergelijken met een referentiegenoom. Kijken wat er fout is,
bepalen of er SNPs zijn, mutaties identificeren, farmacogenetica (hoe snel wordt een
medicijn gemetaboliseerd)
3. Sequentiebepaling als teller: kijken hoeveel sequenties er aanwezig zijn in de mix
Novo Genoom Sequentie Bepaling: Volledige genoom bepalen (WHOLE GENOME
SEQUENCING)
- DNA wordt in stukjes gebroken en van alle stukjes wordt de sequentie bepaald →
Daarna wordt alles naast elkaar gelegd (kijken naar welke volgorde van sequenties)
- Vorming van het referentiegenoom
1
,Requencing: Genoom van individu wordt vergelijken met referentiegenoom
- Kijken naar SNP of mutaties
Als men kijkt naar een kankergenoom
- Tumoren zijn vaak ontstaan door coderende mutaties (in exonen) → Niet veel zin om
het volledige genoom na te kijken
- → Whole Exon Sequencing (WES) doen = enkel naar exonen (coderende
sequenties) kijken → Kostprijs ligt ook veel lager
Kijken naar een mutatie die ligt op het X-Chromosoom
- Kijken naar een specifiek deel in het genoom = Targeted Sequencing
1.1 Eerste Generatie Sequentiebepaling
Chemisch klieving methode: niet kennen voor examen
Sanger Sequencing = Nieuw Synthese met dideoxy-keten
- Nodig: DNA polymerase, amplicon, primer, dNTP, ddATP
- De zuurstof die aanwezig is op DNA suikergroep (bij dNTP) = vormt het
aanhechtingspunt voor een andere nucleotide → Vorming van DNA Streng
- ddNTP bevat geen zuurstof → Geen ketenvorming → Reactie gaat stoppen
Eerst radioactief labelen → Daarna fluorescent maken
- Verschillende fluorescente labels gebruiken
voor de verschillende lengten van fragmenten
- Naargelang de grootte van het DNA fragment:
ander fluorescent signaal
- → Hiermee de sequentie bepalen
Normale dNTP: bevat OH groep op C3
ddNTP: bevat geen OH groep op C3
- De OH groep gaat fosfodiester verbindingen vormen in de DNA keten
2
, Template = Gefragmenteerde genoom dat geamplificeerd wordt door
kloneren of een specifiek fragment dat geamplificeerd wordt met PCR
Polymerasen zijn thermostabiel en kunnen dNTPs en ddNTPs
inbouwen
Capillaire gelelektroforese: Kleine fragmentjes komen voorbij de
sensor en worden afgelezen
- Langste fragmentje wordt als laatste afgelezen
- Links - Rechts = Klein - Groot
- In beeld brengen via elektroferogram (Eerste 20-30
basenparen zijn moeilijk om af te lezen → Signaal is te sterk en het is moeilijk om te
onderscheiden welke base het is)
Per base: Phred Score (probabiliteit) toegekend over hoe zeker je bent dat de base juist is
dat je afleest
- Score is 10 → 1 op 10 is er een foute base
Mutatie detectie
Bij mutant: Lezen twee basen af
- Hoe komt dit? Door heterozygote SNP (beide allelen hebben op die positie een
verschillend nucleotide en de sequentie-reactie geeft van beide allelen signalen)
- Komt door een insertie, deletie in 1 van de twee allelen (1 allel heeft een extra base tov
de andere allel)
Humaan ● Bloed wordt afgestaan van verschillende individuen en daarna wordt dit
Genoom Project gesequenced
(HGP) ● Methode die gebruikt wordt voor HGP: Hierarchical Shotgun Sequencing met
Sanger Methode
● YAC = je kan grote stukken DNA (2 miljoen basenparen) in stoppen
3
, ● DNA wordt doorgegeven: kloneren van YAC en dat komt vervolgens in BAC, en
verder
● De DNA fragmenten worden gekloneerd in de YAC, BAC, P1s, Cosmiden
● Cosmiden = kleinste, wordt uiteindelijk gesequendeerd
● Het heeft 5 jaar geduurd om de fragmenten in YAC, BAC, P1, cosmiden te stoppen
(mapping en fragmentation)
● Ieder groot kloon (bijv. een BAC) wordt apart verkleind in random kleine
stukken (1–2 kb).
● Die kleine stukken worden gekloneerd en gesequenced met de Sanger-methode.
● De stalen werden verdeeld over labo’s die deelnemen aan HGP en daar
werden de DNA sequenties afgelezen (100-den toestellen werden op hetzelfde
moment gebruikt over heel de wereld)
● Open science: elke 24u werden er sequenties vrijgegeven
● Data werd ter beschikking gesteld in databanken (NCBI / Ensemble / UCSC)
HGP door Celera ● Methode = Whole genome Shotgun Sequencing: random cloning en geen mapping
Genomics ● Het genoom werd in kleine stukjes verdeeld en achteraf heeft hij de
verschillende stukjes aan elkaar geplakt
Enorme impact op
1. Technologische ontwikkeling van sequencing: automatisering, aanpak
2. Grote ontwikkeling in bio-informatica (stijging in sequentie data)
3. Open Science en Open data
4. Biologische kennis: vergelijken van normale sequentie en op zoek gaan naar
mutaties in die genen
5. Genomics: kijken hoeveel groepen genetisch verschillen van elkaar (evolutie)
6. Van telomeer tot telomeer lezen
→ Mogelijkheden van Personalized Precision Medicine
- Weten wat de kans is dat er bepaalde complicaties / aandoeningen zich gaan
ontwikkelen
4
Hoofdstuk 2: Analyse van DNA en Genomics
1. DNA Sequentiebepaling
First generation sequencing: Sanger
- Kloneren, elektroforese (scheiding van fragmenten op grootte)
- Veel gebruikt voor kleine projecten
Second generation sequencing: NGS (Next Generation Sequencing)
- Gebaseerd op short read (30-100 bp)
- Met alle sequencen puzzelen we een volledig humaan genoom
- Illumina, ion Torrent
Third Generation sequencing: Next-next generation Sequencing
- Kijken naar hele lang fragmenten van DNA (duizenden, miljoenen bp)
- Belangrijk bij een repetitieve sequentie om daardoor te lezen
- Individuele moleculen gaan sequencing
- Geen amplificatie
- Nanopore, PacBio
Brede toepassingen
1. Novo Genoom Sequentie bepaling: ongekende genomen worden gesequenced
2. Requencing: individuen vergelijken met een referentiegenoom. Kijken wat er fout is,
bepalen of er SNPs zijn, mutaties identificeren, farmacogenetica (hoe snel wordt een
medicijn gemetaboliseerd)
3. Sequentiebepaling als teller: kijken hoeveel sequenties er aanwezig zijn in de mix
Novo Genoom Sequentie Bepaling: Volledige genoom bepalen (WHOLE GENOME
SEQUENCING)
- DNA wordt in stukjes gebroken en van alle stukjes wordt de sequentie bepaald →
Daarna wordt alles naast elkaar gelegd (kijken naar welke volgorde van sequenties)
- Vorming van het referentiegenoom
1
,Requencing: Genoom van individu wordt vergelijken met referentiegenoom
- Kijken naar SNP of mutaties
Als men kijkt naar een kankergenoom
- Tumoren zijn vaak ontstaan door coderende mutaties (in exonen) → Niet veel zin om
het volledige genoom na te kijken
- → Whole Exon Sequencing (WES) doen = enkel naar exonen (coderende
sequenties) kijken → Kostprijs ligt ook veel lager
Kijken naar een mutatie die ligt op het X-Chromosoom
- Kijken naar een specifiek deel in het genoom = Targeted Sequencing
1.1 Eerste Generatie Sequentiebepaling
Chemisch klieving methode: niet kennen voor examen
Sanger Sequencing = Nieuw Synthese met dideoxy-keten
- Nodig: DNA polymerase, amplicon, primer, dNTP, ddATP
- De zuurstof die aanwezig is op DNA suikergroep (bij dNTP) = vormt het
aanhechtingspunt voor een andere nucleotide → Vorming van DNA Streng
- ddNTP bevat geen zuurstof → Geen ketenvorming → Reactie gaat stoppen
Eerst radioactief labelen → Daarna fluorescent maken
- Verschillende fluorescente labels gebruiken
voor de verschillende lengten van fragmenten
- Naargelang de grootte van het DNA fragment:
ander fluorescent signaal
- → Hiermee de sequentie bepalen
Normale dNTP: bevat OH groep op C3
ddNTP: bevat geen OH groep op C3
- De OH groep gaat fosfodiester verbindingen vormen in de DNA keten
2
, Template = Gefragmenteerde genoom dat geamplificeerd wordt door
kloneren of een specifiek fragment dat geamplificeerd wordt met PCR
Polymerasen zijn thermostabiel en kunnen dNTPs en ddNTPs
inbouwen
Capillaire gelelektroforese: Kleine fragmentjes komen voorbij de
sensor en worden afgelezen
- Langste fragmentje wordt als laatste afgelezen
- Links - Rechts = Klein - Groot
- In beeld brengen via elektroferogram (Eerste 20-30
basenparen zijn moeilijk om af te lezen → Signaal is te sterk en het is moeilijk om te
onderscheiden welke base het is)
Per base: Phred Score (probabiliteit) toegekend over hoe zeker je bent dat de base juist is
dat je afleest
- Score is 10 → 1 op 10 is er een foute base
Mutatie detectie
Bij mutant: Lezen twee basen af
- Hoe komt dit? Door heterozygote SNP (beide allelen hebben op die positie een
verschillend nucleotide en de sequentie-reactie geeft van beide allelen signalen)
- Komt door een insertie, deletie in 1 van de twee allelen (1 allel heeft een extra base tov
de andere allel)
Humaan ● Bloed wordt afgestaan van verschillende individuen en daarna wordt dit
Genoom Project gesequenced
(HGP) ● Methode die gebruikt wordt voor HGP: Hierarchical Shotgun Sequencing met
Sanger Methode
● YAC = je kan grote stukken DNA (2 miljoen basenparen) in stoppen
3
, ● DNA wordt doorgegeven: kloneren van YAC en dat komt vervolgens in BAC, en
verder
● De DNA fragmenten worden gekloneerd in de YAC, BAC, P1s, Cosmiden
● Cosmiden = kleinste, wordt uiteindelijk gesequendeerd
● Het heeft 5 jaar geduurd om de fragmenten in YAC, BAC, P1, cosmiden te stoppen
(mapping en fragmentation)
● Ieder groot kloon (bijv. een BAC) wordt apart verkleind in random kleine
stukken (1–2 kb).
● Die kleine stukken worden gekloneerd en gesequenced met de Sanger-methode.
● De stalen werden verdeeld over labo’s die deelnemen aan HGP en daar
werden de DNA sequenties afgelezen (100-den toestellen werden op hetzelfde
moment gebruikt over heel de wereld)
● Open science: elke 24u werden er sequenties vrijgegeven
● Data werd ter beschikking gesteld in databanken (NCBI / Ensemble / UCSC)
HGP door Celera ● Methode = Whole genome Shotgun Sequencing: random cloning en geen mapping
Genomics ● Het genoom werd in kleine stukjes verdeeld en achteraf heeft hij de
verschillende stukjes aan elkaar geplakt
Enorme impact op
1. Technologische ontwikkeling van sequencing: automatisering, aanpak
2. Grote ontwikkeling in bio-informatica (stijging in sequentie data)
3. Open Science en Open data
4. Biologische kennis: vergelijken van normale sequentie en op zoek gaan naar
mutaties in die genen
5. Genomics: kijken hoeveel groepen genetisch verschillen van elkaar (evolutie)
6. Van telomeer tot telomeer lezen
→ Mogelijkheden van Personalized Precision Medicine
- Weten wat de kans is dat er bepaalde complicaties / aandoeningen zich gaan
ontwikkelen
4
