Examenvragen genetica hoofdstuk 4
1. Geef schematisch het proces van kloneren weer + de criteria van een goede vector
- Isolatie/zuivering van het DNA dat uit weefsel, orgaan of cellen is gehaald
o Openbreken van de cel
o Scheiding van het DNA van het overige celmateriaal zoals RNA en eiwitten
- Fragmentering: eventuele fragmentering van het gezuiverde DNA
o Dubbelstrengbreuken onder mechanische stress
Lineair DNA
Breken van DNA strengen gebeurt willekeurig en er ontstaan fragmenten
van ongeveer gelijke lengte
o Enzymatisch
DNA wordt geknipt op welbepaalde plaatsen waarvan de sequentie
hetzelfde is
Ligeren gaat zo gemakkelijker
De lengte van de bekomen fragmenten is sterk afhankelijk van de
aanwezige herkenningsplaatsen
o Knippen: restrictie endonucleasen
- Scheiding: de bekomen DNA fragmenten worden van elkaar gescheiden op basis van
fragmentlengte
o Agarose gelelektroforese
o Polyacrylamide gelelektroforese
- Ligatie: het te kloneren DNA fragment wordt in een vector gebracht met de vorming van
een recombinante DNA molecule
o Covalent aan elkaar binden van DNA = ligatie mbv ligase
- Transformatie van de recombinante DNAs worden in bacteriën gebracht om ze te
vermeerderen
o Plasmiden spontaan opnemen
o Bacteriën met CaCl2 behandelen zodat het membraan van de bacteriën gaat
modificeren en ze permeabel wordt voor DNA
o Elektroporatie = elektrisch veld onderwerpen waardoor er kortstondig poriën
ontstaan en het plasmide naar binnen kan
- Adressering, individuele kolonies worden naar aparte buisjes overgebracht en gecodeerd
Een kloneringsvector is een drager DNA molecule waarin een 2 e DNA fragment stabiel kan
geïntegreerd worden en vervolgens vermeerderd kan worden. Een goeie kloneringsvector
heeft 3 voorwaarden:
- Een kleine goed gekarakteriseerde DNA molecule
- Kan zichzelf en het opgenomen fragment vermeerderen
- De hybride molecule kan gemakkelijk gerecupereerd en gekarakteriseerd worden
Er zijn verschillende vectoren beschikbaar afhankelijk van de grootte van de DNA fragmenten
, 2. Wat is een transgeen dier? Beschrijf in detail de techniek/methode die u zou gebruiken om
aan te tonen dat een welbepaald dier transgeen is.
Een transgeen dier is een organisme dat een vreemd gen van een ander soort organisme in
zijn DNA heeft. Transgenese kan een spontaan natuurlijk proces zijn maar komt meestal door
de genetische technologie van de mens. Een transgeen dier is een dier waarbij er een
gentransfer naar de kiemcellijn is gebeurt en deze kan doorgeven aan zijn nakomelingen.
Transgenen kan je gaan opsporen:
- Je kan er een gemakkelijk te volgen merkergen in inbouwen zodat je achteraf kan gaan
bepalen welk dier het transgeen dier is.
- Je kan weefselspecifieke promotors gaan inbouwen zodat het transgen enkel in bepaalde
cellen/weefsels tot expressie zal komen
- Je kan een transgeen dier ook gaan herkennen aan vachtkleur, maar meestal wordt een
PCR toegepast en dan sequencing om te achterhalen of het transgen aanwezig is.
o Het merkergen wordt door PCR geamplificeerd, dan heb je denaturatie,
hybridisatie en polymerisatie
- Sequentiebepaling door de Sanger methode
o Het geprimede DNA wordt in 4 buisjes gestoken
o In elk buisje wordt DNA polymerase dNTPs gestoken en een ddNTP
o De ddNTPs missen een vrije 3’ OH groep waardoor de DNA polymerase gaat
stoppen als ze deze tegenkomen en je dus ketens krijgt met verschillende lengtes
o De 4 buisjes worden op een PAGE aangebracht
o Nu is er sequentiebepaling adhv de ketenlengte
o We controleren of de specifieke sequentie van de merkergen ertussen zit
3. Welke factoren bepalen of 2 DNA fragmenten al dan niet aan elkaar kunnen gehecht worden
door een DNA ligase?
De DNA fragmenten moeten door hetzelfde RE gegenereerd worden. Dan pas kan de
herkenningsplaats van het RE na de ligatie opnieuw hersteld worden. De uiteinden die
gecreëerd worden moeten compatibel zijn. De vrije 3’ OH groep en 5’ fosfaatgroep mogen
niet tegenover elkaar zitten anders kan ligase geen fosfodiësterverbinding vormen.
4. Leg het MAS uit
MAS= marker assisted selection: voor veel multifactoriële kenmerken zijn de mutaties die
hiervoor zorgen niet gekend, maar kennen we wel de DNA merkers die aan het kenmerk
gekoppeld zijn. De bruikbaarheid van de merker wordt bepaald door zijn chromosomale
afstand met de oorzakelijke mutatie.
Principe: een gen X heeft 2 allelen N en d met N het wildtype dominant allen en d het
mutante allel dat in homozygote toestand defect is. Het gen X is nog niet geïdentificeerd dus
kunnen we ook de mutatie die voor allel d zorgt niet weten. We kunnen dus geen
onderscheid maken tussen homozygoot normale dieren en heterozygoten op basis van
genotypering van gen X. Linkage toont aan dat de merker met codominante allelen A en B
sterk gekoppeld is aan het gen X. Hierdoor kan de merker gebruikt worden om het genotype
van de individuen met betrekking tot gen X te voorspellen en tegen allel d te selecteren. Hoe
nauwkeuriger de linkage tussen de merker en het gen X, hoe minder fouten bij de
voorspelling van de genotypes.
1. Geef schematisch het proces van kloneren weer + de criteria van een goede vector
- Isolatie/zuivering van het DNA dat uit weefsel, orgaan of cellen is gehaald
o Openbreken van de cel
o Scheiding van het DNA van het overige celmateriaal zoals RNA en eiwitten
- Fragmentering: eventuele fragmentering van het gezuiverde DNA
o Dubbelstrengbreuken onder mechanische stress
Lineair DNA
Breken van DNA strengen gebeurt willekeurig en er ontstaan fragmenten
van ongeveer gelijke lengte
o Enzymatisch
DNA wordt geknipt op welbepaalde plaatsen waarvan de sequentie
hetzelfde is
Ligeren gaat zo gemakkelijker
De lengte van de bekomen fragmenten is sterk afhankelijk van de
aanwezige herkenningsplaatsen
o Knippen: restrictie endonucleasen
- Scheiding: de bekomen DNA fragmenten worden van elkaar gescheiden op basis van
fragmentlengte
o Agarose gelelektroforese
o Polyacrylamide gelelektroforese
- Ligatie: het te kloneren DNA fragment wordt in een vector gebracht met de vorming van
een recombinante DNA molecule
o Covalent aan elkaar binden van DNA = ligatie mbv ligase
- Transformatie van de recombinante DNAs worden in bacteriën gebracht om ze te
vermeerderen
o Plasmiden spontaan opnemen
o Bacteriën met CaCl2 behandelen zodat het membraan van de bacteriën gaat
modificeren en ze permeabel wordt voor DNA
o Elektroporatie = elektrisch veld onderwerpen waardoor er kortstondig poriën
ontstaan en het plasmide naar binnen kan
- Adressering, individuele kolonies worden naar aparte buisjes overgebracht en gecodeerd
Een kloneringsvector is een drager DNA molecule waarin een 2 e DNA fragment stabiel kan
geïntegreerd worden en vervolgens vermeerderd kan worden. Een goeie kloneringsvector
heeft 3 voorwaarden:
- Een kleine goed gekarakteriseerde DNA molecule
- Kan zichzelf en het opgenomen fragment vermeerderen
- De hybride molecule kan gemakkelijk gerecupereerd en gekarakteriseerd worden
Er zijn verschillende vectoren beschikbaar afhankelijk van de grootte van de DNA fragmenten
, 2. Wat is een transgeen dier? Beschrijf in detail de techniek/methode die u zou gebruiken om
aan te tonen dat een welbepaald dier transgeen is.
Een transgeen dier is een organisme dat een vreemd gen van een ander soort organisme in
zijn DNA heeft. Transgenese kan een spontaan natuurlijk proces zijn maar komt meestal door
de genetische technologie van de mens. Een transgeen dier is een dier waarbij er een
gentransfer naar de kiemcellijn is gebeurt en deze kan doorgeven aan zijn nakomelingen.
Transgenen kan je gaan opsporen:
- Je kan er een gemakkelijk te volgen merkergen in inbouwen zodat je achteraf kan gaan
bepalen welk dier het transgeen dier is.
- Je kan weefselspecifieke promotors gaan inbouwen zodat het transgen enkel in bepaalde
cellen/weefsels tot expressie zal komen
- Je kan een transgeen dier ook gaan herkennen aan vachtkleur, maar meestal wordt een
PCR toegepast en dan sequencing om te achterhalen of het transgen aanwezig is.
o Het merkergen wordt door PCR geamplificeerd, dan heb je denaturatie,
hybridisatie en polymerisatie
- Sequentiebepaling door de Sanger methode
o Het geprimede DNA wordt in 4 buisjes gestoken
o In elk buisje wordt DNA polymerase dNTPs gestoken en een ddNTP
o De ddNTPs missen een vrije 3’ OH groep waardoor de DNA polymerase gaat
stoppen als ze deze tegenkomen en je dus ketens krijgt met verschillende lengtes
o De 4 buisjes worden op een PAGE aangebracht
o Nu is er sequentiebepaling adhv de ketenlengte
o We controleren of de specifieke sequentie van de merkergen ertussen zit
3. Welke factoren bepalen of 2 DNA fragmenten al dan niet aan elkaar kunnen gehecht worden
door een DNA ligase?
De DNA fragmenten moeten door hetzelfde RE gegenereerd worden. Dan pas kan de
herkenningsplaats van het RE na de ligatie opnieuw hersteld worden. De uiteinden die
gecreëerd worden moeten compatibel zijn. De vrije 3’ OH groep en 5’ fosfaatgroep mogen
niet tegenover elkaar zitten anders kan ligase geen fosfodiësterverbinding vormen.
4. Leg het MAS uit
MAS= marker assisted selection: voor veel multifactoriële kenmerken zijn de mutaties die
hiervoor zorgen niet gekend, maar kennen we wel de DNA merkers die aan het kenmerk
gekoppeld zijn. De bruikbaarheid van de merker wordt bepaald door zijn chromosomale
afstand met de oorzakelijke mutatie.
Principe: een gen X heeft 2 allelen N en d met N het wildtype dominant allen en d het
mutante allel dat in homozygote toestand defect is. Het gen X is nog niet geïdentificeerd dus
kunnen we ook de mutatie die voor allel d zorgt niet weten. We kunnen dus geen
onderscheid maken tussen homozygoot normale dieren en heterozygoten op basis van
genotypering van gen X. Linkage toont aan dat de merker met codominante allelen A en B
sterk gekoppeld is aan het gen X. Hierdoor kan de merker gebruikt worden om het genotype
van de individuen met betrekking tot gen X te voorspellen en tegen allel d te selecteren. Hoe
nauwkeuriger de linkage tussen de merker en het gen X, hoe minder fouten bij de
voorspelling van de genotypes.
