EXAMEN VRAGEN
BIOTECHNOLOGIE EN PROTEÏNE
GM’EN
1. Wat is tPA. In welke cellen kan dit aangemaakt worden en waarom slechts in deze
cellen. Leg uit hoe tPA recombinant aangemaakt wordt. Vermeld welke elementen
er allemaal aanwezig moeten zijn in de expressievector. (5blz schrijven)
Wat is tPA = tissue plasminogen activator = protease = glycoproteïne
• = GM dat gebruikt wordt bij hartaanval (bij hartinfarct blokkeert een klonter een
bloedvat)
• tPA zal plasminogen (= inactief proteïne precursor) clippen → active plasmine
• Plasmine = protease dat fibrine afbreekt → oplossen van de klonter (= opgebouwd uit
fibrine)
• Fibrine zorgt voor vorming van klonter
• Korte werkingsduur (5-6 min) maar dit is niet erg want gewoon voldoende lang
werken om klonter op te lossen en daarna niet meer
In welke cellen wordt tPA aangemaakt?
• Endogeen tPA wordt aangemaakt in de endotheelcellen
• Recombinant tPA wordt aangemaakt in zoogdiercellen bv. Chinese Hamster Ovary
cells
Waarom enkel in deze cellen?
• Bacteriën kunnen geen glycosylaties (= post-translationele modificatie) uitvoeren
aangezien ze niet over een ER en een Golgi-apparaat beschikken → dus bacteriën
zijn geen optie
• Gisten kunnen wel glycosylaties uitvoeren maar deze zijn te verschillend van
menselijke glycosylaties (bv. high mannose glycosylatie)
• Zoogdiercellen hebben gelijkaardige glycosilaties als mensen maar er is nog steeds
verschil tussen mens en andere spieces.
→ CHO cellen hebben gelijkaardige glycosylaties als de mens en zullen dus het
minst aanleiding geven geven tot immunogeniciteit
,Hoe wordt tPA recombinant aangemaakt? (alles uitleggen: begin vanaf mRNA)
• We nemen cellen van de mens die van nature tPA produceren → RNA → mRNA
isoleren (= codeert voor alle eiwitten) → cDNA → via PCR het gewenste gen (tPA-
gen) isoleren → gen in shuttle vector brengen (deze vector kunnen we ook gwn
aankopen)
• Deze shuttlevector = GEEN expressievector, maar dient enkel voor het tPA gen te
vermenigvuldigen en mbv restrictie-enzymen eruit te knippen en in expressievector te
brengen
→ Onderdelen: open reading frame, origin of replication (voor bacteriën), multiple
cloning site, Amp resistentie gen
→ Mbv ampicilline gaan we selectie doen van enkel de bacteriën die het plasmide
hebben opgenomen (de andere sterven af)
• tPA gen wordt mbv DNA ligase in de expressievector geligeerd
• De expressievector wordt in CHO-cellen overgebracht mbv liposomen/lipid nano
partikels
• Niet alle cellen ontvangen het plasmide maar degene die het wel hebben ontvangen,
zullen bij celdeling het plasmide doorgeven aan slechts 1 dochtercel (= verdunning vh
plasmide)
o Transiente transfectie: plasmide zal na verloop v tijd door CHO cellen
afgebroken worden
o HIER: stabiele transformanten
→ we lineariseren het plasmide mbv restrictie enzymen en ligeren het
vervolgens in het gastheergenoom
(dit gebeurt ad random en bij een beperkt % vd cellen)
• Kwaliteitscontrole: checken of er insert is en of het juiste insert is
o CHO cellen: gemodificeerd zodat ze een deficiëntie hebben in het tk-gen en
het hprt-gen
o HAT-medium: hypoxanthine, aminopterine en thymidine
→ Aminopterine blokkeert de DNA synthese op 2 plaasten
→ Indien er mutatie is in tymidine kinase gen (tk-gen) of hypoxanthine
phosphoribosyltransferase gen (hprt-gent) kunnen cellen niet overleven want
cellen kunnen geen gebruik maken vd salvage pathway
o Methotrexaat: selectie van cellen met hoogste rendement/productie van tPA
→ Methotrexaat blokkeert dihydrofolaatreductase (dit gen ligt dicht bij tPA
gen): synthese DNA ↓ en cellen sterven
→ Hoe meer methotrexaat de cel aankan = hoe meer het
dihydrofolaatreductase gen tot expressie komt = hoe meer het tPA gen tot
expressie komt
• Cellen die overblijven zijn niet noodzakelijk monoklonaal dus eerst kloneringsstap
waarbij we 1 cel isoleren om verder te groeien → master cell bank en working cell
bank
• Cellen in cultuur brengen en laten fermenteren → tPA wordt gesecreteerd in het
medium
• tPA opzuiveren uit medium
,Welke elementen moeten er allemaal aanwezig zijn in de expressievector?
• Promotor: specifiek voor zoogdiercellen (hier: cytomegalovirus promotor die
constitutief actief is)
• Terminatie sequentie: hierdoor zal RNA-polymerase stoppen
• HindIII en EcoRI restrictiesites: hiertussen wordt tPA gen geligeerd
• Dihydrofolaat reductase gen
• Tymidine kinase gen
• Hypoxanthine guanine fosforibosyltransferase gen
2. Wat is het verschil tussen een transversie en een transformatie
Transversie = puntmutatie waarbij een purine wordt vervangen door een pyrimidine, of
omgekeerd.
• Purinen: A (adenine) en G (guanine)
• Pyrimidinen: C (cytosine) en T (thymine)
Wat is een transformatie? Hierbij breng je een plasmide in een bacteriële cel. Dit kan op 2
manieren:
• Hitteshock: We maken de cellen competent mbv CaCl2 en steken ze in een ijsbad,
90 sec in 42°C en dan meteen weer in ijsbad → destabilisatie van het celmembraan
waardoor er poriën ontstaan waardoor het plasmide in de cel kan geraken
• Elektroforese: cellen in cuvet met buffer en tussen 2 metalen platen, elektrische
pulsen over het cuvet destabiliseren het celmembraan → proriën → plasmide w
opgenomen
• Zeer lage succes rate
, 3. Je wordt gevraagd een therapeutisch monoklonaal antilichaam te maken tegen
TNF. Hiervoor heb je cellen die TNFalfa tot expressie brengen echter in een te lage
hoeveelheid om te immuniseren. Hoe ga je te werk? (7 pagina’s)
Stap 1: Immunnisatie
• We gaan muizen herhaaldelijk blootstellen aan een Ag (= TNF alfa) → voor muizen is
dit een lichaamsvreemd eiwit dus ze maken ALen aan
→ Eerste keer met Freunds Complete Adjuvant (FCA) = FIA + hittegedode
mycobacteriën (deze interageren met de toll like receptoren en zorgen voor ernstige
inflammatie)
→ Volgende keren immuniseren met Freunds Incomplete Adjuvant (FIA) want anders
weefselschade door FCA en dat is niet ethisch: dit bestaat uit Ag opgelost in water en
geëmulgeerd in olie
• µg-mg hoeveelheden vh immunogeen + adjuvans subcutaan of intradermaal
inspuiten
• Screening met ELISA of muizen het gewenste AL produceren (in milt)
Ja? Euthanaseren en B-cellen extraheren uit de milt
• ELISA: in microtiter 96-well plate Ag laten adhereren aan plastiek → met goedkope
eiwitbron (bv. melkpoeder) overige bindplaatsen op plastiek blokkeren → wasstap →
toevoegen van het primair AL (= muizenserum) → wassen → toevoegen van het
immunoconjugaat (= secundair AL tegen het Fc domein van het primair AL + enzym
aan gelinkt) → wasstap → kleurloos substraat vh enzym toevoegen →
kleur/absorbantie is een maat voor hoeveelheid AL in well
DUS: indien kleur te zien is kunnen we muis euthanaseren
Stap 2: Celfusie
• B-cellen: kunnen niet in cultuur gebracht worden (zullen niet vermenigvuldigen en
spontaan afsterven)
• Plasmacytoma: tumorcel uit het plasma dat eindeloos kan prolifereren (heeft
machinerie om AL aan te maken maar gebruikt deze niet)
• Hybridoma cel: fusie van een B cel en een plasmacytoma
Samenvoeging mbv grote hoeveelheid polyethyleenglycol (PEG) (vroeger werd dit
met Sendai virus gedaan): celmembranen plakken aan elkaar en fusioneren met
elkaar → 1 cel met 2 kernen en dus ook 2 genomen
Bij celdeling verdwijnt kernenvelop en komen DNA’s in contact met elkaar
Bij elke celdeling wordt wat onnodig DNA uitgestoten totdat cel stabiliseert (als ze
aller eruit hebben gegooid dat ze niet nodig hebben)
RESULTAAT: een cel die eindeloos kan proliferen en ALen kan aanmaken
Stap 3: Selectie
• Na celfusie zijn de resulterende cellen: hybridoma cellen (= B cel + plasmacytoma), 2
tumorcellen, 2 B cellen of niet gefuseerde cellen
• We willen enkel hybridomas selecteren
• Hoe? HAT medium (hypoxanthine, aminopterine en thymidine)
B cellen sterven af want kunnen niet in cultuur gebracht worden
Tumorcellen sterven af want hebben mutatie in tymidine kinase-gen en/of
hypoxanthine guanine fosforibosyltransferase gen
Hybrydoma cellen hebben geen mutatie en kunnen dus als enige overleven
BIOTECHNOLOGIE EN PROTEÏNE
GM’EN
1. Wat is tPA. In welke cellen kan dit aangemaakt worden en waarom slechts in deze
cellen. Leg uit hoe tPA recombinant aangemaakt wordt. Vermeld welke elementen
er allemaal aanwezig moeten zijn in de expressievector. (5blz schrijven)
Wat is tPA = tissue plasminogen activator = protease = glycoproteïne
• = GM dat gebruikt wordt bij hartaanval (bij hartinfarct blokkeert een klonter een
bloedvat)
• tPA zal plasminogen (= inactief proteïne precursor) clippen → active plasmine
• Plasmine = protease dat fibrine afbreekt → oplossen van de klonter (= opgebouwd uit
fibrine)
• Fibrine zorgt voor vorming van klonter
• Korte werkingsduur (5-6 min) maar dit is niet erg want gewoon voldoende lang
werken om klonter op te lossen en daarna niet meer
In welke cellen wordt tPA aangemaakt?
• Endogeen tPA wordt aangemaakt in de endotheelcellen
• Recombinant tPA wordt aangemaakt in zoogdiercellen bv. Chinese Hamster Ovary
cells
Waarom enkel in deze cellen?
• Bacteriën kunnen geen glycosylaties (= post-translationele modificatie) uitvoeren
aangezien ze niet over een ER en een Golgi-apparaat beschikken → dus bacteriën
zijn geen optie
• Gisten kunnen wel glycosylaties uitvoeren maar deze zijn te verschillend van
menselijke glycosylaties (bv. high mannose glycosylatie)
• Zoogdiercellen hebben gelijkaardige glycosilaties als mensen maar er is nog steeds
verschil tussen mens en andere spieces.
→ CHO cellen hebben gelijkaardige glycosylaties als de mens en zullen dus het
minst aanleiding geven geven tot immunogeniciteit
,Hoe wordt tPA recombinant aangemaakt? (alles uitleggen: begin vanaf mRNA)
• We nemen cellen van de mens die van nature tPA produceren → RNA → mRNA
isoleren (= codeert voor alle eiwitten) → cDNA → via PCR het gewenste gen (tPA-
gen) isoleren → gen in shuttle vector brengen (deze vector kunnen we ook gwn
aankopen)
• Deze shuttlevector = GEEN expressievector, maar dient enkel voor het tPA gen te
vermenigvuldigen en mbv restrictie-enzymen eruit te knippen en in expressievector te
brengen
→ Onderdelen: open reading frame, origin of replication (voor bacteriën), multiple
cloning site, Amp resistentie gen
→ Mbv ampicilline gaan we selectie doen van enkel de bacteriën die het plasmide
hebben opgenomen (de andere sterven af)
• tPA gen wordt mbv DNA ligase in de expressievector geligeerd
• De expressievector wordt in CHO-cellen overgebracht mbv liposomen/lipid nano
partikels
• Niet alle cellen ontvangen het plasmide maar degene die het wel hebben ontvangen,
zullen bij celdeling het plasmide doorgeven aan slechts 1 dochtercel (= verdunning vh
plasmide)
o Transiente transfectie: plasmide zal na verloop v tijd door CHO cellen
afgebroken worden
o HIER: stabiele transformanten
→ we lineariseren het plasmide mbv restrictie enzymen en ligeren het
vervolgens in het gastheergenoom
(dit gebeurt ad random en bij een beperkt % vd cellen)
• Kwaliteitscontrole: checken of er insert is en of het juiste insert is
o CHO cellen: gemodificeerd zodat ze een deficiëntie hebben in het tk-gen en
het hprt-gen
o HAT-medium: hypoxanthine, aminopterine en thymidine
→ Aminopterine blokkeert de DNA synthese op 2 plaasten
→ Indien er mutatie is in tymidine kinase gen (tk-gen) of hypoxanthine
phosphoribosyltransferase gen (hprt-gent) kunnen cellen niet overleven want
cellen kunnen geen gebruik maken vd salvage pathway
o Methotrexaat: selectie van cellen met hoogste rendement/productie van tPA
→ Methotrexaat blokkeert dihydrofolaatreductase (dit gen ligt dicht bij tPA
gen): synthese DNA ↓ en cellen sterven
→ Hoe meer methotrexaat de cel aankan = hoe meer het
dihydrofolaatreductase gen tot expressie komt = hoe meer het tPA gen tot
expressie komt
• Cellen die overblijven zijn niet noodzakelijk monoklonaal dus eerst kloneringsstap
waarbij we 1 cel isoleren om verder te groeien → master cell bank en working cell
bank
• Cellen in cultuur brengen en laten fermenteren → tPA wordt gesecreteerd in het
medium
• tPA opzuiveren uit medium
,Welke elementen moeten er allemaal aanwezig zijn in de expressievector?
• Promotor: specifiek voor zoogdiercellen (hier: cytomegalovirus promotor die
constitutief actief is)
• Terminatie sequentie: hierdoor zal RNA-polymerase stoppen
• HindIII en EcoRI restrictiesites: hiertussen wordt tPA gen geligeerd
• Dihydrofolaat reductase gen
• Tymidine kinase gen
• Hypoxanthine guanine fosforibosyltransferase gen
2. Wat is het verschil tussen een transversie en een transformatie
Transversie = puntmutatie waarbij een purine wordt vervangen door een pyrimidine, of
omgekeerd.
• Purinen: A (adenine) en G (guanine)
• Pyrimidinen: C (cytosine) en T (thymine)
Wat is een transformatie? Hierbij breng je een plasmide in een bacteriële cel. Dit kan op 2
manieren:
• Hitteshock: We maken de cellen competent mbv CaCl2 en steken ze in een ijsbad,
90 sec in 42°C en dan meteen weer in ijsbad → destabilisatie van het celmembraan
waardoor er poriën ontstaan waardoor het plasmide in de cel kan geraken
• Elektroforese: cellen in cuvet met buffer en tussen 2 metalen platen, elektrische
pulsen over het cuvet destabiliseren het celmembraan → proriën → plasmide w
opgenomen
• Zeer lage succes rate
, 3. Je wordt gevraagd een therapeutisch monoklonaal antilichaam te maken tegen
TNF. Hiervoor heb je cellen die TNFalfa tot expressie brengen echter in een te lage
hoeveelheid om te immuniseren. Hoe ga je te werk? (7 pagina’s)
Stap 1: Immunnisatie
• We gaan muizen herhaaldelijk blootstellen aan een Ag (= TNF alfa) → voor muizen is
dit een lichaamsvreemd eiwit dus ze maken ALen aan
→ Eerste keer met Freunds Complete Adjuvant (FCA) = FIA + hittegedode
mycobacteriën (deze interageren met de toll like receptoren en zorgen voor ernstige
inflammatie)
→ Volgende keren immuniseren met Freunds Incomplete Adjuvant (FIA) want anders
weefselschade door FCA en dat is niet ethisch: dit bestaat uit Ag opgelost in water en
geëmulgeerd in olie
• µg-mg hoeveelheden vh immunogeen + adjuvans subcutaan of intradermaal
inspuiten
• Screening met ELISA of muizen het gewenste AL produceren (in milt)
Ja? Euthanaseren en B-cellen extraheren uit de milt
• ELISA: in microtiter 96-well plate Ag laten adhereren aan plastiek → met goedkope
eiwitbron (bv. melkpoeder) overige bindplaatsen op plastiek blokkeren → wasstap →
toevoegen van het primair AL (= muizenserum) → wassen → toevoegen van het
immunoconjugaat (= secundair AL tegen het Fc domein van het primair AL + enzym
aan gelinkt) → wasstap → kleurloos substraat vh enzym toevoegen →
kleur/absorbantie is een maat voor hoeveelheid AL in well
DUS: indien kleur te zien is kunnen we muis euthanaseren
Stap 2: Celfusie
• B-cellen: kunnen niet in cultuur gebracht worden (zullen niet vermenigvuldigen en
spontaan afsterven)
• Plasmacytoma: tumorcel uit het plasma dat eindeloos kan prolifereren (heeft
machinerie om AL aan te maken maar gebruikt deze niet)
• Hybridoma cel: fusie van een B cel en een plasmacytoma
Samenvoeging mbv grote hoeveelheid polyethyleenglycol (PEG) (vroeger werd dit
met Sendai virus gedaan): celmembranen plakken aan elkaar en fusioneren met
elkaar → 1 cel met 2 kernen en dus ook 2 genomen
Bij celdeling verdwijnt kernenvelop en komen DNA’s in contact met elkaar
Bij elke celdeling wordt wat onnodig DNA uitgestoten totdat cel stabiliseert (als ze
aller eruit hebben gegooid dat ze niet nodig hebben)
RESULTAAT: een cel die eindeloos kan proliferen en ALen kan aanmaken
Stap 3: Selectie
• Na celfusie zijn de resulterende cellen: hybridoma cellen (= B cel + plasmacytoma), 2
tumorcellen, 2 B cellen of niet gefuseerde cellen
• We willen enkel hybridomas selecteren
• Hoe? HAT medium (hypoxanthine, aminopterine en thymidine)
B cellen sterven af want kunnen niet in cultuur gebracht worden
Tumorcellen sterven af want hebben mutatie in tymidine kinase-gen en/of
hypoxanthine guanine fosforibosyltransferase gen
Hybrydoma cellen hebben geen mutatie en kunnen dus als enige overleven
