Hoofdstuk 1 – Inleiding en techniek
I. Celcultuur en Groeicondities
Het doel van celcultuur is cellen in vitro (in het labo) te laten groeien onder condities die vergelijkbaar
zijn met de situatie in vivo (in het lichaam).
1. Historie en Types
- 3D Tissue Culture (TC) (Harrison, 1907) was de oorspronkelijke methode.
- 2D Monolaagcultures (Earle, 1948) zijn vlakke, eencellige lagen die vaak worden gebruikt.
Normale cellen stoppen met delen wanneer ze een monolaag vormen (contactinhibitie), terwijl
tumorcellen in 3D-hoopjes kunnen groeien (dense foci) omdat ze dit vermogen verloren hebben.
- Cellijnen zijn stabiele (of geïmmortaliseerde) culturen met een theoretisch onbeperkte
levensduur, vaak afkomstig van tumoren.
2. Essentiële Condities
- Medium (MEM): Groeimedia zoals Minimum Essential Medium (MEM) bevatten isotonische
zouten (o.a. NaHCO3/H2CO3-buffer), glucose als energiebron, essentiële aminozuren en
vitamines.
- Serum: Serum is nagenoeg essentieel maar introduceert kwaliteitsvariatie.
- Atmosfeer: Cellen moeten groeien onder een atmosfeer van 5% CO2 (vergelijkbaar met bloed)
om de juiste pH (7,4) te behouden.
- Substraat: Voor de meeste celtypes (adherente cellen) is een substraat essentieel. Dit
substraat (bijv. glas of behandeld polystyreen) biedt een fysische drager en beschermt de cel
tegen anoïkis (geprogrammeerde celdood/apoptose). Coatings zoals poly-D-lysine of collageen
kunnen worden gebruikt om de in vivo situatie (Extracellulaire Matrix, ECM) na te bootsen.
3. Celtransfer (Passeren)
- Adherente cellen worden 'gesplitst' wanneer ze confluente monolagen vormen.
- Dit gebeurt met de trypsine/EDTA-procedure (TE).
o Trypsine: Een protease die de oppervlakte-eiwitten van de cel degradeert.
o EDTA: Een cheleermiddel dat calcium en magnesium bindt, wat de intercellulaire
adhesie en de cel-substraatbinding verstoort.
- Dit proces maakt de cellen los, waardoor ze een monocellulaire suspensie vormen die verdund
en uitgezaaid kan worden.
1
,II. Stamcellen en Kwaliteitscontrole
1. Typen Stamcellen
Stamcellen hebben twee eigenschappen: zelfvernieuwing (zichzelf delen) en het vermogen om te
differentiëren in andere celtypes.
- Totipotent: Kan zich tot een volledige foetus ontwikkelen (eerste uren na bevruchting).
- Pluripotent: Kan differentiëren in vele, maar niet alle celtypes (bijv. de Inner Cell Mass/ICM van
de blastocyst).
- Multipotent: Beperkt tot de ontwikkeling van een meer gespecialiseerd celtype (bijv.
hematopoëtische stamcellen, die alleen bloedcellen kunnen vormen).
- iPSCs (geïnduceerde pluripotente stamcellen): Somatische cellen die geherprogrammeerd
zijn tot pluripotente cellen. Deze zijn ethisch minder beladen dan embryonale stamcellen.
2. Kwaliteitscontrole en Stabiliteit
- Contaminatie: Cellen kunnen besmet raken met micro-organismen (bacteriën, gisten,
schimmels, mycoplasma’s) of vreemde cellen (bijv. HeLa-cellen).
- Mycoplasma: Is moeilijk te detecteren en te elimineren, en kan leiden tot ernstige effecten
zoals chromosomale afwijkingen en verstoring van het cellulaire metabolisme.
- Zuiverheid en Stabiliteit: De genetische zuiverheid en stabiliteit kunnen worden gemeten
door karyotypering (bepaling van chromosoom aantal en vorm).
- Stock Cultures: Om genetische instabiliteit te beperken, moet men regelmatig terugkeren
naar ingevroren stock-cultures, die worden bewaard in vloeibare stikstof (-196°C) met
cryoprotectieve middelen zoals glycerol of DMSO.
III. Preparatie voor Microscopie
Biologisch materiaal is meestal te dik voor licht- of elektronenstralen en heeft te weinig contrast.
Histologische technieken zijn nodig om het weefsel dun en observeerbaar te maken.
Stap Doel Techniek (LM) Techniek (EM)
Glutaraldehyde en
Denatureren van eiwitten om Formol (chemisch) of
Osmiumtetroxide (chemisch,
Fixeren degradatie tegen te gaan en de invriezen (koude fixatie,
OSO4 stabiliseert lipiden en
structuur te behouden. snelle diagnose).
eiwitten).
Materiaal hard maken en Paraffine (hydrofoob).
Hars/Plastics (harder). Vereist
doordringen met een Vereist eerst dehydratie
Inbedden dehydratie met ethanol of
inbedmiddel om dunne coupes (alcoholbaden) en
aceton.
te kunnen snijden. clearing (tolueen).
Snijden Materiaal dun genoeg maken. Met een microtoom en Met een ultramicrotoom en
stalen mes; coupes van glazen/diamanten mes;
2
, ultradunne coupes van 50–100
5–10 µm.
nm (op een metalen gridje).
Zware metalen (Uranylacetaat,
Contraster Zichtbaar maken van details Kleuren (H/E, specifieke
Loodcitraat) die elektronen
en (kleur of elektronenstrooiing). kleurstoffen).
strooien.
IV. Microscopietechnieken
1. Lichtmicroscopie (LM)
De resolutie van LM is maximaal 200 nm.
Type LM Principe Toepassing
Gebruikt doorvallend wit
Klaarveld (Bright
licht. Detectie op basis van Gefixeerde en gekleurde preparaten (bijv. H/E).
Field)
lichtabsorptie.
Zet kleine
faseverschuivingen door
Fasecontrast Ongekleurde, levende cellen.
brekingsverschillen om in
contrast (licht/donker).
Gebaseerd op interferentie
DIC (Nomarski) van doorvallend Ongekleurde, levende cellen.
gepolariseerd licht.
Detectie van ionen (bijv. Fura-2 voor Ca2+),
Fluorochromen absorberen
Immunofluorescentie, en eiwit tagging (bijv. GFP)
Fluorescentie excitatie licht (korte
in levende cellen. CLSM (Confocale Laser
(Epifluorescentie/CLS golflengte) en zenden
Scanning Microscopie) gebruikt een laser en een
M) emissie licht (langere
pinhole om licht van buiten het focusvlak tegen
golflengte, Stokes shift) uit.
te houden, wat zorgt voor betere optische secties.
Combinatie van snelle 3D
multi-kleur opnames over Analyse van dynamische processen in levende
4D Live Cell Imaging
de tijd (time lapse cellen.
recording).
H/E Kleuring: De meest gebruikte routinekleuring.
- Hematoxyline: Kationisch (basisch), positief geladen. Kleurt negatief geladen, basofiele
componenten (zoals nucleïnezuren in de kern) donker blauw-paars.
- Eosine: Anionisch (zuur), negatief geladen. Kleurt positief geladen, acidofiele componenten
(zoals aminozuren in cytoplasmatische eiwitten) roze.
2. Elektronenmicroscopie (EM)
3
I. Celcultuur en Groeicondities
Het doel van celcultuur is cellen in vitro (in het labo) te laten groeien onder condities die vergelijkbaar
zijn met de situatie in vivo (in het lichaam).
1. Historie en Types
- 3D Tissue Culture (TC) (Harrison, 1907) was de oorspronkelijke methode.
- 2D Monolaagcultures (Earle, 1948) zijn vlakke, eencellige lagen die vaak worden gebruikt.
Normale cellen stoppen met delen wanneer ze een monolaag vormen (contactinhibitie), terwijl
tumorcellen in 3D-hoopjes kunnen groeien (dense foci) omdat ze dit vermogen verloren hebben.
- Cellijnen zijn stabiele (of geïmmortaliseerde) culturen met een theoretisch onbeperkte
levensduur, vaak afkomstig van tumoren.
2. Essentiële Condities
- Medium (MEM): Groeimedia zoals Minimum Essential Medium (MEM) bevatten isotonische
zouten (o.a. NaHCO3/H2CO3-buffer), glucose als energiebron, essentiële aminozuren en
vitamines.
- Serum: Serum is nagenoeg essentieel maar introduceert kwaliteitsvariatie.
- Atmosfeer: Cellen moeten groeien onder een atmosfeer van 5% CO2 (vergelijkbaar met bloed)
om de juiste pH (7,4) te behouden.
- Substraat: Voor de meeste celtypes (adherente cellen) is een substraat essentieel. Dit
substraat (bijv. glas of behandeld polystyreen) biedt een fysische drager en beschermt de cel
tegen anoïkis (geprogrammeerde celdood/apoptose). Coatings zoals poly-D-lysine of collageen
kunnen worden gebruikt om de in vivo situatie (Extracellulaire Matrix, ECM) na te bootsen.
3. Celtransfer (Passeren)
- Adherente cellen worden 'gesplitst' wanneer ze confluente monolagen vormen.
- Dit gebeurt met de trypsine/EDTA-procedure (TE).
o Trypsine: Een protease die de oppervlakte-eiwitten van de cel degradeert.
o EDTA: Een cheleermiddel dat calcium en magnesium bindt, wat de intercellulaire
adhesie en de cel-substraatbinding verstoort.
- Dit proces maakt de cellen los, waardoor ze een monocellulaire suspensie vormen die verdund
en uitgezaaid kan worden.
1
,II. Stamcellen en Kwaliteitscontrole
1. Typen Stamcellen
Stamcellen hebben twee eigenschappen: zelfvernieuwing (zichzelf delen) en het vermogen om te
differentiëren in andere celtypes.
- Totipotent: Kan zich tot een volledige foetus ontwikkelen (eerste uren na bevruchting).
- Pluripotent: Kan differentiëren in vele, maar niet alle celtypes (bijv. de Inner Cell Mass/ICM van
de blastocyst).
- Multipotent: Beperkt tot de ontwikkeling van een meer gespecialiseerd celtype (bijv.
hematopoëtische stamcellen, die alleen bloedcellen kunnen vormen).
- iPSCs (geïnduceerde pluripotente stamcellen): Somatische cellen die geherprogrammeerd
zijn tot pluripotente cellen. Deze zijn ethisch minder beladen dan embryonale stamcellen.
2. Kwaliteitscontrole en Stabiliteit
- Contaminatie: Cellen kunnen besmet raken met micro-organismen (bacteriën, gisten,
schimmels, mycoplasma’s) of vreemde cellen (bijv. HeLa-cellen).
- Mycoplasma: Is moeilijk te detecteren en te elimineren, en kan leiden tot ernstige effecten
zoals chromosomale afwijkingen en verstoring van het cellulaire metabolisme.
- Zuiverheid en Stabiliteit: De genetische zuiverheid en stabiliteit kunnen worden gemeten
door karyotypering (bepaling van chromosoom aantal en vorm).
- Stock Cultures: Om genetische instabiliteit te beperken, moet men regelmatig terugkeren
naar ingevroren stock-cultures, die worden bewaard in vloeibare stikstof (-196°C) met
cryoprotectieve middelen zoals glycerol of DMSO.
III. Preparatie voor Microscopie
Biologisch materiaal is meestal te dik voor licht- of elektronenstralen en heeft te weinig contrast.
Histologische technieken zijn nodig om het weefsel dun en observeerbaar te maken.
Stap Doel Techniek (LM) Techniek (EM)
Glutaraldehyde en
Denatureren van eiwitten om Formol (chemisch) of
Osmiumtetroxide (chemisch,
Fixeren degradatie tegen te gaan en de invriezen (koude fixatie,
OSO4 stabiliseert lipiden en
structuur te behouden. snelle diagnose).
eiwitten).
Materiaal hard maken en Paraffine (hydrofoob).
Hars/Plastics (harder). Vereist
doordringen met een Vereist eerst dehydratie
Inbedden dehydratie met ethanol of
inbedmiddel om dunne coupes (alcoholbaden) en
aceton.
te kunnen snijden. clearing (tolueen).
Snijden Materiaal dun genoeg maken. Met een microtoom en Met een ultramicrotoom en
stalen mes; coupes van glazen/diamanten mes;
2
, ultradunne coupes van 50–100
5–10 µm.
nm (op een metalen gridje).
Zware metalen (Uranylacetaat,
Contraster Zichtbaar maken van details Kleuren (H/E, specifieke
Loodcitraat) die elektronen
en (kleur of elektronenstrooiing). kleurstoffen).
strooien.
IV. Microscopietechnieken
1. Lichtmicroscopie (LM)
De resolutie van LM is maximaal 200 nm.
Type LM Principe Toepassing
Gebruikt doorvallend wit
Klaarveld (Bright
licht. Detectie op basis van Gefixeerde en gekleurde preparaten (bijv. H/E).
Field)
lichtabsorptie.
Zet kleine
faseverschuivingen door
Fasecontrast Ongekleurde, levende cellen.
brekingsverschillen om in
contrast (licht/donker).
Gebaseerd op interferentie
DIC (Nomarski) van doorvallend Ongekleurde, levende cellen.
gepolariseerd licht.
Detectie van ionen (bijv. Fura-2 voor Ca2+),
Fluorochromen absorberen
Immunofluorescentie, en eiwit tagging (bijv. GFP)
Fluorescentie excitatie licht (korte
in levende cellen. CLSM (Confocale Laser
(Epifluorescentie/CLS golflengte) en zenden
Scanning Microscopie) gebruikt een laser en een
M) emissie licht (langere
pinhole om licht van buiten het focusvlak tegen
golflengte, Stokes shift) uit.
te houden, wat zorgt voor betere optische secties.
Combinatie van snelle 3D
multi-kleur opnames over Analyse van dynamische processen in levende
4D Live Cell Imaging
de tijd (time lapse cellen.
recording).
H/E Kleuring: De meest gebruikte routinekleuring.
- Hematoxyline: Kationisch (basisch), positief geladen. Kleurt negatief geladen, basofiele
componenten (zoals nucleïnezuren in de kern) donker blauw-paars.
- Eosine: Anionisch (zuur), negatief geladen. Kleurt positief geladen, acidofiele componenten
(zoals aminozuren in cytoplasmatische eiwitten) roze.
2. Elektronenmicroscopie (EM)
3
