Samenvatting H3 - Methoden in het biomedisch onderzoek 2 (U03D7a)

3. RNA
3.1 WERKEN MET EN BEWAREN VAN RNA
Verschil tussen RNA en DNA:

a) DNA:
- Deoxy ribose suikers (mist 2’ OH-
groep)
- Dubbelstrengig
- Thymine (in plaats van Uracil)
- Stabiel (door afwezigheid 2’ OH-
groep)
b) RNA:
- Ribose suiker (wel een 2’ OH-groep)
- Enkelstrengig
- Uracil (in plaats van Thymine
- Veel onstabieler dan DNA (omdat RNA wel een 2’ OH-groep heeft  kan
makkelijk worden afgebroken)

Soorten RNA:

- Coderend RNA
o mRNA (coderend RNA)
o tRNA (zorgt voor eiwitproductie) betrokken in translatie
o rRNA (grootste deel)
- niet-coderend RNA
o long non-coding RNA
o small non-coding RNA

Structuur mRNA:

 RNA wordt gecodeerd op het DNA via een
promotor  RNA wordt hiervan afgeschreven
(transcriptie)  2 structuren worden toegevoegd:

 5’ methyl-groep op guanine (cap)
= bescherming van het RNA voor
exonucleases
= startplek voor de ribosomen (voor
translatie)
 3’ poly-A staart
= stabiliteit van het RNA neemt toe

Exonucleases: breken baseparen af vanaf de zijkant
Endonucleases: breken baseparen af vanaf de binnenkant

, pre-mRNA (met intronen en exonen) is heel kort aanwezig  wordt
onmiddellijk gespliced naar mRNA  intronen verdwijnen en exonen worden aan
elkaar geplakt

,Problemen met het werken met RNA:

1. Stabiliteit: RNA is zowel chemisch als enzymatisch instabiel (RNAses
kunnen worden geactiveerd worden en zo is je mRNA niet meer bruikbaar
= degradatie van het RNA)
2. RNA profiel kan veranderen: inductie van bepaalde genen die er normaal
niet zijn (door bijvoorbeeld een verandering in temperatuur)
3. Contaminatie: scheiding van DNA en RNA is moeilijk (dus je kan soms DNA
in het RNA-staal hebben zitten)

Staalname: je wilt dat er niks meer veranderd aan het RNA na de staalname
= snel stabiliseren

- Onmiddellijk invriezen (in vloeibare stikstof)
- RNA-bewaarmiddelen gebruiken (voor bloedstalen)
- RNAlater (ammoniumsulfaat oplossing  precipiteert eiwitten) voor
weefsels en cellen

Staalverwerking: RNAse-vrij werken

- ALTIJD HANDSCHOENEN EN LABOJAS
- Zeer zuiver werken: afgebakende zone waar enkel met RNA gewerkt
wordt en die regelmatig gekuist wordt
o RNAse schoonmaakproduct (bijvoorbeeld: RNAseZAP)
o RNAse vrije filters, pipettips, …
- Buffers moeten RNAse-vrij zijn
o Milli-Q, …
o Behandeling met RNAse inhibitoren
 DEPC: reageert met amines in AZ (vooral met histidine dat
in het katalytisch centrum zit waardoor dit geïnhibeerd
wordt)
 Nieuwere RNAse inhibitoren

Bewaring van de stalen:

- RNAse-vrij water (geen EDTA  inhibiteert DNA)
- Minder lang bewaren dan DNA (1 jaar op -80°C)
- Alcoholprecipitaat (langer bewaren)
- RNA verdelen over meerdere epjes (zodat je het RNA niet telkens moet
ontdooien en terug invriezen)

, DNA-contaminatie:

- Detecteren
o RTmin controle: om te kijken of er DNA-contaminatie is
= als er contaminatie aanwezig is moet je DNAse toevoegen
- Verwijderen: DNAse behandeling
o Toevoegen van DNAse tijdens of na RNA extractie
o DNAse 1 (knipt dsDNA en ssDNA  afhankelijk of je Magnesium
of Mangaan toevoegt)
o Na verwijderen van het DNA moet de DNAse verdwijnen:
inactiveren (hitte) of verwijderen na behandeling
 Nadeel: verlies of degradatie van RNA mogelijk (daarom
doen we dit liever niet)




3.2 RNA EXTRAHEREN
Algemeen: 3 stappen

1. Lysis: cellen afbreken zodat RNA vrijkomt
 Lysaat = vloeistof met inhoud van gelyseerde cellen
2. Isoleren: RNA uit het lysaat halen of opzuiveren (extraheren)
 Zonder eiwitten, eventueel zonder DNA
3. Oplossen: RNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen
 Concentreren (= meer RNA in kleiner volume aanmaken)

Keuze van methode afhankelijk van:

- Startmateriaal (weefsel, bloed, celcultuur, bacteriecultuur,..)
- Doel (gewenste hoeveelheid, kwaliteit, aantal stalen…)