H9 Eiwit technieken
1. Heterologe eiwitexpressie
Heterologe eiwitten worden aangemaakt in een organisme of cellen
waarin ze normaal niet worden geproduceerd en ontstaan door
klonering van genen.
Kloneren is het proces waarbij meerdere, identieke kopieën van een
bepaald stuk DNA worden gemaakt in een bepaalde gastheer. In
prokaryoten is E. coli de meest gebruikte gastheer voor kloneren.
Specifieke DNA-fragmenten worden ingebracht in plasmiden, dit zijn
circulaire DNA-moleculen die, onafhankelijk van het bacterieel genoom,
kunnen repliceren. Van deze plasmiden worden veel kopieën van het
DNA-fragment aangemaakt in de cel.
Kloneren wordt vaak gebruikt voor de productie van heterologe eiwitten
in een gastheer, bijvoorbeeld als geneesmiddel. Daarnaast wordt
kloneren ook gebruikt om een gemuteerd gen in een cel te herstellen,
waardoor het opnieuw het juiste eiwit kan aanmaken. Via klonering kan
je ook een tag aan eiwitten toevoegen, zodat de eiwitten makkelijker
kunnen worden gezuiverd of zichtbaar gemaakt in cellen en weefsels.
Restrictie-enzymen (RE) zijn bacteriële eiwitten die specifieke korte
DNA-palindroom-sequenties knippen. Er bestaan honderden RE die
afkomstig zijn van verschillende bacteriën, met elk hun eigen,
specifieke, herkenningssequentie. RE zijn endonucleasen die dsDNA in
fragmenten knipt met compatibele uiteinden.
o 5'-overhangende uiteinden (sticky ends)
o 3'-overhangende uiteinden (sticky ends)
o stompe uiteinden (blunt ends)
Na een digest met RE kunnen de DNA-fragmenten via gel elektroforese
vergeleken worden met een ladder van fragmenten met gekende
lengte.
Om te kloneren wordt plasmide DNA opengeknipt met RE (= de vector)
en wordt een specifiek DNA-fragment van interesse met RE uit het
genoom geknipt (= het insert).
Tussen een vector en insert met complementaire uiteinden kunnen
spontaan H-bruggen gevormd worden. In een ligatie-reactie worden ze
covalent gekoppeld met behulp van het enzym DNA ligase, dat de
nucleotiden verbindt door fosfodiesterbindingen te vormen.
Door een DNA-fragment in een plasmide te brengen, ontstaat een
nieuw continu en stabiel recombinant plasmide.
Er bestaan verschillende vectoren om in te kloneren, die steeds grotere
inserts kunnen opnemen
o Plasmiden
o Bacteriofagen
o Cosmiden (hybride plasmiden met bacteriofaag sequenties voor
linearisatie)
Als gastheer kan je gebruik maken van bacteriën, gisten, eukaryote
cellen of organismen. Bacteriofagen vormen plaques in een plaat met
bacteriën door lyse van de bacteriën.
Recombinante plasmiden kunnen op verschillende manieren in een
gastheer worden binnengebracht.
1
, o Transformatie: plasmide binnenbrengen in een prokaryote cel
o Transfectie: plasmide binnenbrengen in een eukaryote cel
o Transductie: virus binnenbrengen in een eukaryote cel
Plasmiden bezitten een selectiemerker, vb. een antibiotica resistentie
gen waardoor getransformeerde bacteriën geselecteerd kunnen worden
op platen met antibiotica. Alleen de bacteriën die het plasmide hebben
opgenomen, kunnen groeien, omdat ze resistent zijn tegen het
antibioticum dat aanwezig is in de voedingsbodem. Bacteriën zónder
het plasmide zullen niet overleven, maar bacteriën mét het correcte
plasmide vormen elk een kolonie op de voedingsbodem.
Getransformeerde bacteriën worden gekweekt in vloeibare culturen om
de recombinante plasmiden te produceren of het recombinant eiwit tot
expressie te brengen. Deze bacteriën doen dienst als eiwitfabrieken die,
met behulp van de juiste controle elementen, het ingebrachte gen tot
expressie brengen waarbij mRNA wordt gevormd, dat daarna wordt
vertaald in eiwit. Daarna worden de bacteriële cellen gelyseerd, om het
eiwit vrij te maken.
Heterologe eiwitten zoals humaan insuline, worden gezuiverd uit de
eigen eiwitten en andere macromoleculen van de gastheer met
bijvoorbeeld
affiniteitschromatografie.
2. Proteomics
Eiwitten worden bestudeerd in het onderzoeksdomein proteomics als
studie van alle eiwitten die zich, op een gegeven moment, onder
bepaalde omstandigheden, in een bepaalde cel of weefsel bevinden.
Op basis van mRNA worden zo’n miljoen verschillende eiwitten
geproduceerd die geïdentificeerd worden en waarvan de interacties
tussen verschillende eiwitten onderling en hun effect op de vorm of
activiteit cel nagegaan worden.
Voor de analyse van de structuur, functie, expressie en sequentie van
eiwitten, wordt gebruikt gemaakt van speciale scheidings- en
zuiverings- en identificatie-technieken, methoden voor kwantificatie en
expressie, en onderzoek naar eiwitten in het kader van diagnostiek.
3. Eiwit-elektroforese
Elektroforese maakt gebruik van een elektrisch veld om geladen
moleculen door een gelmatrix te bewegen.
Eiwitten bewegen in een polyacrylamide gel (PAGE) naar de elektrode
met tegengestelde lading.
2
1. Heterologe eiwitexpressie
Heterologe eiwitten worden aangemaakt in een organisme of cellen
waarin ze normaal niet worden geproduceerd en ontstaan door
klonering van genen.
Kloneren is het proces waarbij meerdere, identieke kopieën van een
bepaald stuk DNA worden gemaakt in een bepaalde gastheer. In
prokaryoten is E. coli de meest gebruikte gastheer voor kloneren.
Specifieke DNA-fragmenten worden ingebracht in plasmiden, dit zijn
circulaire DNA-moleculen die, onafhankelijk van het bacterieel genoom,
kunnen repliceren. Van deze plasmiden worden veel kopieën van het
DNA-fragment aangemaakt in de cel.
Kloneren wordt vaak gebruikt voor de productie van heterologe eiwitten
in een gastheer, bijvoorbeeld als geneesmiddel. Daarnaast wordt
kloneren ook gebruikt om een gemuteerd gen in een cel te herstellen,
waardoor het opnieuw het juiste eiwit kan aanmaken. Via klonering kan
je ook een tag aan eiwitten toevoegen, zodat de eiwitten makkelijker
kunnen worden gezuiverd of zichtbaar gemaakt in cellen en weefsels.
Restrictie-enzymen (RE) zijn bacteriële eiwitten die specifieke korte
DNA-palindroom-sequenties knippen. Er bestaan honderden RE die
afkomstig zijn van verschillende bacteriën, met elk hun eigen,
specifieke, herkenningssequentie. RE zijn endonucleasen die dsDNA in
fragmenten knipt met compatibele uiteinden.
o 5'-overhangende uiteinden (sticky ends)
o 3'-overhangende uiteinden (sticky ends)
o stompe uiteinden (blunt ends)
Na een digest met RE kunnen de DNA-fragmenten via gel elektroforese
vergeleken worden met een ladder van fragmenten met gekende
lengte.
Om te kloneren wordt plasmide DNA opengeknipt met RE (= de vector)
en wordt een specifiek DNA-fragment van interesse met RE uit het
genoom geknipt (= het insert).
Tussen een vector en insert met complementaire uiteinden kunnen
spontaan H-bruggen gevormd worden. In een ligatie-reactie worden ze
covalent gekoppeld met behulp van het enzym DNA ligase, dat de
nucleotiden verbindt door fosfodiesterbindingen te vormen.
Door een DNA-fragment in een plasmide te brengen, ontstaat een
nieuw continu en stabiel recombinant plasmide.
Er bestaan verschillende vectoren om in te kloneren, die steeds grotere
inserts kunnen opnemen
o Plasmiden
o Bacteriofagen
o Cosmiden (hybride plasmiden met bacteriofaag sequenties voor
linearisatie)
Als gastheer kan je gebruik maken van bacteriën, gisten, eukaryote
cellen of organismen. Bacteriofagen vormen plaques in een plaat met
bacteriën door lyse van de bacteriën.
Recombinante plasmiden kunnen op verschillende manieren in een
gastheer worden binnengebracht.
1
, o Transformatie: plasmide binnenbrengen in een prokaryote cel
o Transfectie: plasmide binnenbrengen in een eukaryote cel
o Transductie: virus binnenbrengen in een eukaryote cel
Plasmiden bezitten een selectiemerker, vb. een antibiotica resistentie
gen waardoor getransformeerde bacteriën geselecteerd kunnen worden
op platen met antibiotica. Alleen de bacteriën die het plasmide hebben
opgenomen, kunnen groeien, omdat ze resistent zijn tegen het
antibioticum dat aanwezig is in de voedingsbodem. Bacteriën zónder
het plasmide zullen niet overleven, maar bacteriën mét het correcte
plasmide vormen elk een kolonie op de voedingsbodem.
Getransformeerde bacteriën worden gekweekt in vloeibare culturen om
de recombinante plasmiden te produceren of het recombinant eiwit tot
expressie te brengen. Deze bacteriën doen dienst als eiwitfabrieken die,
met behulp van de juiste controle elementen, het ingebrachte gen tot
expressie brengen waarbij mRNA wordt gevormd, dat daarna wordt
vertaald in eiwit. Daarna worden de bacteriële cellen gelyseerd, om het
eiwit vrij te maken.
Heterologe eiwitten zoals humaan insuline, worden gezuiverd uit de
eigen eiwitten en andere macromoleculen van de gastheer met
bijvoorbeeld
affiniteitschromatografie.
2. Proteomics
Eiwitten worden bestudeerd in het onderzoeksdomein proteomics als
studie van alle eiwitten die zich, op een gegeven moment, onder
bepaalde omstandigheden, in een bepaalde cel of weefsel bevinden.
Op basis van mRNA worden zo’n miljoen verschillende eiwitten
geproduceerd die geïdentificeerd worden en waarvan de interacties
tussen verschillende eiwitten onderling en hun effect op de vorm of
activiteit cel nagegaan worden.
Voor de analyse van de structuur, functie, expressie en sequentie van
eiwitten, wordt gebruikt gemaakt van speciale scheidings- en
zuiverings- en identificatie-technieken, methoden voor kwantificatie en
expressie, en onderzoek naar eiwitten in het kader van diagnostiek.
3. Eiwit-elektroforese
Elektroforese maakt gebruik van een elektrisch veld om geladen
moleculen door een gelmatrix te bewegen.
Eiwitten bewegen in een polyacrylamide gel (PAGE) naar de elektrode
met tegengestelde lading.
2
